膀胱尿路上皮癌，亦称膀胱癌（ b l a d d e r cancer,BCa）是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，全球 发病率呈上升趋势。2013年，美国预计新增72 570 例BCa患者，其中15 210例患者将死于BCa^[1]。Bca 临床表现有血尿、膀胱刺激症状、排尿困难等， 严重影响患者的生活质量，肌层浸润性BCa危害尤 甚。目前对浸润性BCa最有效的治疗方式是采用根 治性全膀胱切除术，同时配合化疗、放疗、免疫治 疗等方案。但是，根治性全膀胱切除术后2年内仍 约有50%的患者会发生复发、转移,并最终死于肿 瘤^[2]。BCa术后容易复发、转移的原因可能是BCa 的“肿瘤干细胞”（cancer stem cells,CSCs）没有被 清除或消灭。

CSCs是目前国际上肿瘤研究的热点，近年 来的研究表明：肿瘤是由一群功能异质性的细胞 组成，只有小部分癌细胞具有干细胞特性，具有 自我更新和分化成不同肿瘤细胞的能力，具有无 限增殖潜能且能在动物体内形成肿瘤的能力，并 在启动肿瘤形成和生长，维持肿瘤的恶性增殖、 侵袭、转移、复发和耐药等方面起着决定性的作 用。研究人员将肿瘤组织中这小部分致瘤能力 强、有自我更新和分化潜能的细胞称为CSCs^{[3, 4]}。

早在1994年Lapidot等^[5]采用重症联合免疫缺陷 小鼠移植实验，从急性髓性白血病患者分离到的 肿瘤细胞中，筛选出小部分具有特殊标志的细胞 能在小鼠中促发白血病。这一小部分具有特殊标 志的肿瘤细胞后来被称为CSCs，或被称为肿瘤起 始细胞。随后在多种肿瘤中成功筛选出了CSCs， 包括白血病、神经肿瘤、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、头颈部肿瘤、胃癌、肺癌、膀胱癌 等^[6]。BCa肿瘤组织中也存在CSCs。膀胱癌肿瘤 干细胞（BCa-CSCs）在膀胱癌预后所起的作用与 CSCs标志物相关。如CK14，非浸润性膀胱癌CK14 表达水平上调，则与肿瘤复发和恶化呈正相关，而 与总的生存期呈负相关^[7]。再如p63，一种主要在基 底细胞中表达的蛋白，p63表达水平增高与肌层浸 润性膀胱癌患者的生存期下降密切相关^[8]。目前针 对BCa-CSCs的治疗包括有常规的细胞毒药物治疗、 靶向治疗等^[9]。为攻克BCa，深入研究BCa-CSCs的 分子生物学特性尤为重要。而如何简便高效地筛选 得到BCa-CSCs是开展研究的一个关键问题。本文 就BCa-CSCs筛选方法的研究进展综述如下。 1 根据细胞表面的特异标志物筛选

由于CSCs表面标志物的特异性，利用相应的 单克隆抗体可将CSCs与普通肿瘤细胞区分开来， 主要通过流式细胞技术分选法(FACS)或免疫磁珠 细胞分选法(MACS)。

细胞表面标志有助于识别、鉴定和分离细 胞，因此确定一类细胞的表面标志在研究中显得 非常重要。为了更好地研究CSCs，确定CSCs的表 面标志是非常必要的。目前，鉴定CSCs最为权威 的方法就是筛选确定肿瘤干细胞特异的细胞表面 标志物，并根据这些标志物分离CSCs^[10]。一般程 序为：原代培养CSCs；根据细胞表面特异性标志 物，采用流式细胞仪分离肿瘤干细胞样细胞；鉴 定其自我更新能力、增殖能力和分化能力；最后 将细胞移植入免疫缺陷小鼠中进行成瘤实验，以 鉴定细胞的成瘤能力。 1.1 CD44

CD44可能是大部分肿瘤的CSCs标志物。尽 管在不同的细胞CD44的表达水平有着比较明显的 差别，但是CD44几乎对所有类型肿瘤都起着重要 的调节作用，对评价预后有重要的意义^[11]。2009 年，Chan等从19例人膀胱癌组织中找到膀胱癌高 致瘤细胞子集的标志物CD44+，他们利用新鲜膀 胱癌样本和RAG2-/γc-老鼠进行肿瘤起始实验，证 实在相同样本中，CD44+细胞比CD44−细胞更容易 导致肿瘤的发生^[10]。2011年，Tatokoro等从5 637 细胞系中筛选CD44+肿瘤起始细胞，可以比CD44− 耐受顺铂，同时用热休克蛋白90 (Hsp90)抑制剂治 疗可以抑制其耐药^[12]。尽管如此，Hatina等则认 为CD44可能是某些肿瘤干细胞标志物，但并不是 BCa-CSCs一个通用的标志物^[13]。 1.2 上皮细胞膜抗原（EMA）

EMA的分布与膀胱癌患者的生存密切相关，是评价预后情况的一个有价值的指标；CD44v6是 CD44的亚型，Yang等认为膀胱癌肿瘤起始细胞存 在于CD44v6+EMA−亚群中^{[14, 15]}。 1.3 67-kDa层黏蛋白受体（67LR）

2009年，He等用流式细胞术从SW780细胞系 中分选出67LR⁺细胞，它的致瘤能力至少是普通肿 瘤细胞的10倍以上，同时还检测发现CEACAM6− 细胞致瘤能力是普通肿瘤细胞的70倍，CK17则与 67LR+细胞共同表达高水平^[16]。 1.4 5-乙醛脱氢酶（ALDH）

ALDH被认为是一种可能的干性标志物。 ALDH1是ALDH家族的一个子集，通过氧化乙 醛变成羧酸使细胞去毒的NAD（P）+相关酶。 2010年，Su等从人膀胱癌细胞株HTB-2，HTB-4， HTB-9中筛选出ALDH1A1阳性细胞，与ALDH1A1 阴性细胞相比较具有更强的体外成瘤能力，而且 体内成瘤实验所形成的肿瘤组织形态特点与母代 相似，认为ALDH1A1阳性细胞可能富含膀胱癌肿 瘤起始细胞^[17]。Falso等在2012年发现T24和5637细 胞系中也有高表达ALDH的类似CSCs，较低表达 ALDH细胞更能耐受抗肿瘤药物顺铂^[18]。 1.5 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）

2008年，Kurzrock等^[19]用BrdU腹腔注射小鼠 后从膀胱肿瘤组织中分离出标志阻滞细胞，认为 其是CSCs样细胞，发现此类细胞位于膀胱壁的基 底层同时表达α6和β1整合蛋白。 1.6 其他

朱朝辉等^{[ 20, 21]}通过对49例人膀胱癌标本和人膀 胱癌细胞系Biu-87研究发现膀胱癌中有少量细胞表 达全能干细胞标志物Oct-4，认为这些细胞很可能 是膀胱癌干细胞，将为其最终分离Ba-CSCs提供重 要的基础。王卫生等^{[ 22]}则通过对32例膀胱癌标本 研究发现另外一个表达全能干细胞标志物Nanog， 为揭示Ba-CSCs的存在并分离提供依据。 2 侧群（SP）细胞分选法筛选

1996 年Goodell等^{[ 23]}在用DNA染料Hoechst33342 为干细胞染色并进行FACS分析时，发现有一群 染色偏低，和其他大部分细胞不一样的细胞群 体，遂命名为SP细胞，研究中同时发现这类细胞 具有干细胞的性质。SP细胞是指一小群能将DNA 结合染料Hoechst33342排出细胞外的细胞，具有 干细胞特性，可用于表面标志物未知的CSCs的 筛选分离。SP细胞分选法进行分选必须借助流 式细胞仪，利用SP细胞能特异性外排荧光染料 Hoechst33342，且此种特性能被Verapamil阻滞的 原理，将SP细胞分离纯化，并进行各项成瘤能力检测。

该方法认为S P 细胞高度表达AT P 结合盒 （ABC） 膜转运蛋白（ 如ABCG1 、ABCG2 等），能泵出进入细胞内的化疗药物和染料。 Diestra等^{[ 24]}用免疫组织化学法对膀胱癌组织研究 后发现，ABC转运蛋白超家族成员中的ABCB1/ P-glycoprotein，ABCC1/MDR及ABCG2/BCRP在 膀胱癌中的表达率明显高于正常膀胱组织，并且 与膀胱癌细胞的分化周期及患者预后存在一定关 系。SP细胞的分离纯化和ABC转运蛋白超家族有 密切关系。2008年，She等^{[ 25]}最早用SP细胞分选法 从SW780、HT-1197、UM-UC-6等膀胱癌肿瘤细 胞株中成功地筛选出具有无限增殖、分化、高致 瘤性等特性的Ba-CSCs。随后，Ning等^{[ 26]}发现膀胱 癌细胞株T24中含有比例很高的SP细胞，这些SP 细胞有干细胞样细胞的特点；黄盛松等^{[ 27]}对T24、 5637、Biu-87、EJ等5种人膀胱移行细胞癌细胞系 进行检测，分选其中的SP细胞，认为含有大量干 细胞样肿瘤细胞，对化疗药物有一定耐药性。

由于SP细胞中大量表达ABC转运蛋白，因此 针对膀胱癌SP细胞的研究可能为膀胱癌的治疗提 供精确的靶点，利用ABC转运蛋白超家族抑制剂 的作用可能有助于膀胱癌细胞耐药性的逆转，为 膀胱癌的治疗提供了新的思路^{[ 28]}。 3 无血清悬浮培养法筛选

无血清悬浮培养是一种体外富集干细胞的手 段，最早用于神经干细胞的培养，后推广到乳腺 癌、脑肿瘤等其他肿瘤用来富集CSCs。肿瘤细胞 对于无血清培养条件的适应过程本身就是一种筛 选方式。在无血清的培养环境中，大部分非CSCs 由于无法耐受长期无血清悬浮生长而逐渐凋亡， 只有CSCs才可以存活下来并开始增殖。CSCs具有 环境依赖性，对于无血清培养条件有着较为严格 的要求。B27含有细胞生长所需的多种生长因子， 是理想的无血清培养添加剂。EGF与FGF-b在无血 清培养的细胞体外增殖中也起着重要作用。同时 为减少细胞发生贴壁机会，一般采用超低吸附孔 板进行培养。

曹正国等^[29]用无血清悬浮培养法从人膀胱移 行细胞癌细胞株Biu-87中分离获得悬浮细胞球，认 为是CSCs样细胞，形成球体的时间为8~9天传一 代。2012年，Zhang等^[30]在抗癌药物顺铂筛选基础 上用无血清培养方法从T24中筛选出能耐受顺铂的 类Ba-CSCs。考虑到不同的肿瘤细胞之间存在着特 异性，因此，适合CSCs生长的无血清培养液在不 同的细胞，不同的实验中存在不同的组合方式。适合某种CSCs生长的无血清培养液对于另外一种 CSCs则可能出现不适合，甚至相反的情况。因 此，建议进行无血清悬浮培养法之前需要对最佳 无血清的组合进行筛选。 4 化疗药物法筛选

根据CSCs理论，CSCs相比较肿瘤细胞更能耐 受化疗药物，在化疗药物存在的培养环境中，大 部分非CSCs由于无法耐受而逐渐凋亡，而CSCs可 以存活并增殖。基于该假设，有学者于2009年首 用该方法筛选分离出肝癌CSCs^[31]。随后，Li等应 用化疗药物法从膀胱移行细胞癌细胞株T24中筛选 出Ba-CSCs^[32]。 5 其他可以借鉴的筛选方法

除了上述四种方法外，研究人员在其他癌或 肉瘤等恶性肿瘤中运用不同的方法也分离筛选出 相应的CSCs，这些CSCs与各自的肿瘤细胞相较， 都具有较强的CSCs特征。这些筛选方法都具有各 自某方面的优点，值得借鉴参考。 5.1 三维无血清条件培养结合抗癌药物法筛选

周松等^[33]将来源于人体的骨肉瘤细胞种植于 1.2%藻酸盐凝胶中，同时置于添加有阿霉素的无 血清培养液中培养，分离所得的单克隆细胞既能 表达干细胞基因Oct3/4和Nanog，又表现出明显的 体内致瘤性和抗肿瘤药特性，可能为人骨肉瘤干 细胞。 5.2 吸附能力梯度法筛选

Walia等^[34]根据胰酶消化乳腺癌细胞时间的不 同将其分成胰酶敏感型和胰酶抵抗型细胞，发现 胰酶敏感型细胞形成肿瘤球的能力是胰酶抵抗型 细胞的80倍，从而用吸附能力的不同来分选出乳 腺癌干细胞。吸附能力梯度法操作简单，所需费 用低，值得在其他肿瘤细胞中应用。 5.3 侵袭能力差异法筛选

Yu等^[35]利用恶性胶质瘤U87细胞穿透Transwell 小室能力的差异将CSCs分离出来，发现分选出的 CSCs肿瘤克隆球形成率高达41.02%，与未分选的 U87细胞0.79%相比较差异有统计学意义。 5.4 Fibronectin差别黏附法筛选

王海等^[36]获取原代软骨终板细胞后接种于 Fibronectin 包被过的培养瓶，筛选得到软骨终板干 细胞，基本符合国际细胞治疗协会对间充质干细 胞的定义标准。相对琼脂糖悬浮培养法筛选法， Fibronectin差别黏附筛选法能达到同样的筛选效果。 5.5 克隆形态学差异法筛选

Zhou等^[37]低密度培养神经胶质瘤U251细胞两周后，用克隆环（cloning cylinder）分离出紧密、 中等、疏松的克隆球，三种细胞形态的克隆球克 隆形成率分别是11.9%、61.0%和27.1%，经鉴定比 较后认为形态紧密的克隆球具有干细胞特征。 5.6 自体荧光技术筛选

Clement等^[38]用神经胶质瘤的表型特征代替分子 标志物CD133，利用自体荧光技术方法，用488 nm激 发光分选出FL1+细胞，具有体外自我更新、体内 成瘤能力和干性基因表达等CSCs特征，是神经胶 质瘤起始细胞。 5.7 电离辐射诱导法筛选

根据CSCs理论，CSCs相比较肿瘤细胞除了更 能耐受化疗药物，同时也更能耐受放疗。Ghisolfi 等^[39]选用肝癌细胞系HepG2和Huh7，将其暴露于 0~10戈瑞不同剂量伽玛射线后，再用无血清培养 液进行培养。结果发现经电离辐射诱导后细胞具 有更高的克隆球形成率，同时伴有干性基因Sox2 和Oct3/4的上调。 5.8 线粒体膜电位差异筛选

Ye等^[40]认为线粒体膜电位反应线粒体的功能 状态，与细胞的分化、肿瘤形成能力及恶性程度 相关。他们根据线粒体膜电位的差异从大肠癌细 胞株SW620中筛选分离CSCs。 5.9 密度梯度法筛选

Liu等^[41]利用肝CSCs的物理特性代替免疫组织 化学特点，运用离心机转速差异将不同密度的肝 肿瘤细胞分离成四个梯度，鉴定后发现第三部分 密度的细胞富集CSCs。 6 目前筛选Ba-CSCs存在的问题与展望

目前最常应用于Ba-CSCs筛选方法主要是根据 细胞表面的特异标志物筛选，SP细胞分选法筛选 和无血清悬浮培养法筛选三种方法，但是单独采 用其中某种方法均有不足之处。细胞特异标志物 筛选分选法分选细胞时需要事先知道CSCs的标志 物，而在干细胞标志物不明确的前提下无法使用 此法筛选，而且此分选方法价格较昂贵且对机器 要求较高，不易于普及。更重要的是所谓的CSCs 标志物能否说明其就是真正的标志物还有待商 榷。现在单独运用一个CSCs标志物已经不适合用 于分选，代替的是用多种的标志物联合使用从BCa 中分选出Ba-CSCs。而SP细胞分选法得到的分离后 的细胞不是真正意义上的干细胞，而是干细胞样 细胞，需要进一步的分离纯化和多方面的鉴定。 无血清培养法只能收集原有培养瓶内的CSCs的数 量，难以增加干细胞在所含细胞内的比例。这两 种筛选方法最大的局限就在于筛选出的CSCs纯度不高^[33]。最后需要强调的是，无论如何针对Ba- CSCs进行干预处理或者治疗，都不能为此而过度 损害正常的膀胱尿路上皮细胞^[13]。因此，是否可 以结合现有筛选方法的各自优点，不断摸索、完 善、优化，从而得到一种简便高效筛选Ba-CSCs的 方法，这可能是今后Ba-CSCs筛选方法研究的发展 方向。