瘤体的过快生长造成瘤体内因血液供应不足 所致的缺氧，在肿瘤的恶性进展过程中发挥重要 作用。缺氧诱导因子1-α（hypoxia induced factor- 1α，HIF-1α）是缺氧状态下的重要核转录因子，通过调控多个靶基因参与促进肿瘤的血管增生、 转移、耐药等恶性行为^{[1, 2, 3]}。目前研究发现，HIF- 1α在多种实体瘤包括乳腺癌、前列腺癌、肝癌 及结肠癌中表达上调，且缺氧导致的HIF-1α上 调诱发肿瘤细胞发生上皮-间叶转化（epithelialmesenchymal transition,EMT），促进肿瘤细胞迁 移、侵袭和转移，从而获得侵袭性表型^{[4, 5, 6]}。然 而，HIF-1α能否通过EMT途径促进宫颈癌细胞的 侵袭、转移，目前尚缺乏此方面的研究。因此，本 研究采用氯化钴（CoCl₂）诱导的化学缺氧处理人 宫颈鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma,SCC） 细胞系Siha细胞，观察缺氧对人宫颈SCC Siha细胞 表型和侵袭能力的影响并探讨其可能机制。

兔抗人E-cadherin单克隆抗体和兔抗人HIF- 1α多克隆抗体（美国Epitomics公司），兔抗人 vimentin多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公 司），鼠抗人GAPDH单克隆抗体（美国Santa公 司），SABC免疫组织化学试剂盒（武汉博士德 生物工程有限公司），HRP标记二抗和cy-3标记 二抗（武汉谷歌生物科技有限公司），DAPI染 色液（碧云天生物技术研究所），TRIzol（美 国Invitrogen公司），Matrigel胶(美国BD公司)， Transwell小室(美国Milipore公司)，人宫颈SCC Siha细胞系（美国ATCC实验室）。高糖型DMEM 培养液（美国Gibco公司）。胎牛血清（杭州四 季青公司）。氯化钴（CoCl₂）购自美国Sigma 公司。PCR引物由武汉擎科新业生物技术有限公 司设计合成。实时定量反转录试剂盒购于日本 TaKaRa公司。

人宫颈SCC Siha细胞用DMEM完全培养液， 在37℃、5%CO₂培养箱中培养，缺氧处理是在常 氧条件的基础上将缺氧模拟剂CoCl₂加入培养液 中，终浓度为200 μmol/L，用于模拟肿瘤内部的缺 氧微环境。未加CoCl₂处理的为常氧对照组，CoCl₂ 处理组为缺氧组。

细胞接种于6孔板内，待细胞密度达到100%时 用10 μl小枪头经孔板中心垂直划“+”字，记0 h并拍 照，于划痕后12、24、48 h拍照并计算愈合率（各 时间点划痕距离/0 h划痕距离）。

用无血清DMEM调整细胞浓度为2×10⁵ cells/ml， 在Transwell孔板上室加入200 μl细胞悬液，下室加 入600 μl DMEM完全培养液，缺氧组上室加入CoCl₂ （200 μmol/L），与常氧组一起置于37℃、5%CO₂培 养箱孵育48 h。棉签轻轻拭去上室内未贴壁的细胞， 4%多聚甲醛固定滤膜，结晶紫染色10 min，高倍显 微镜计数穿透到滤膜下层的细胞数，每孔随机选 择5个视野，结果求平均值。侵袭实验在Transwell 小室半透膜表面包被按1 ：8比例稀释的50 mg/L matrigel（每孔100 μl）置37℃培养箱中，30 min成 凝胶，再向上室加入细胞悬液，余同前述，各项 实验重复3次。

分别收集缺氧组及常氧组Siha细胞提取总蛋 白，按照试剂盒的操作步骤进行蛋白定量。60 μg 蛋白进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据 Marker蛋白分离条带，切下电泳后目的蛋白凝胶。 电转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，一 抗（稀释浓度为HIF-1α 1:200、E-cadherin 1:1 000、 vimentin 1:1 000和GAPDH 1:8 000）4℃孵育过夜。 室温洗膜，于HRP标记的二抗溶液中37℃孵育1 h。 ECL显色，采用chemi-genius凝胶成像系统分析蛋 白条带相对表达量。

准备好常氧组及缺氧组（CoCl₂处理48 h） 的爬片Siha细胞，光学显微镜下观察细胞形态学 改变并拍照，4%多聚甲醛固定，1%Triton-100 的PBS预处理后1%BSA封闭。HIF( 1 : 4 0 0 ) 、 E-cadherin(1:500)4℃孵育过夜，分别用AP及cy-3标 记的二抗工作液37℃避光孵育1 h，苏木精及DAPI 分别染核10 min，显微镜观察细胞并拍照。

Trizol提取总RNA，将2 μg总RNA反转录为 稳定的cDNA，扩增PCR的引物序列见表 1。扩增 条件是：95℃ 2min；95℃ 10s，57℃ 30s，72℃ 30s，40个循环。收集荧光，记录扩增曲线和溶解 曲线，记录每个样本的目的基因Ct值和内参照Ct 值（Ct值为扩增产物的荧光信号达到设定的阈值 时所经过的扩增循环次数），以GAPDH为内参 照，常氧组为对照组，采用2^-ΔΔct的方法计算各目的 基因的相对表达量。

表 1 实时定量PCR扩增引物序列及检测扩增片段大小 Table 1 Primers sequences amplified by qRT-PCR and relevant length

表选项

实验结果采用SPSS19.0软件分析，计量资料 以（x±s）表示，多个样本间的比较采用方差分 析，计量样本间的均数比较用t检验，P<0.05为差 异有统计学意义。

划痕实验结果显示，与常氧组比较，缺氧组 Siha细胞于12、24、48 h的愈合率明显大于常氧 对照组[12 h：(14.5±5.41) % vs.（9.3±3.56）%， 24 h：（58.9±6.32）% vs.（36.7±4.23）%，48 h： （92.7±6.53）% vs.（69.1±5.54）%]，两组于24 h 和48 h时差异有统计学意义（P<0.01），见图 1。

**:P<0.01,hypoxia group vs. normoxia group at different time points 图 1 划痕实验检测缺氧微环境对Siha细胞运动迁移能力的 影响 Figure 1 Effect of hypoxia microenvironment on migration of Siha cells detected by wound-healing assay

图选项

常氧组Siha细胞每高倍视野透膜细胞数为 （213±13），缺氧组每高倍镜视野下的细胞数为 （430±7）；小室半透膜表面铺matrigel胶后，常 氧组siha细胞透膜细胞数为（167±15），缺氧组细 胞透膜细胞数为（311±21），两组比较差异具有 统计学意义（P<0.01）。

观察细胞形态发现Siha细胞经缺氧处理后长 梭形更加明显即间质化形态更加明显，见图 2B； 光学显微镜可见HIF-1α在Siha细胞中聚集，见图 2C，证实CoCl₂成功模拟细胞缺氧状态；细胞免 疫荧光共聚焦结果显示，与常氧组相比EMT的 相关上皮性标志蛋白E-cadherin在缺氧组Siha中 呈现微弱红色荧光，见图 2F。蛋白质印迹法结 果显示，随着缺氧时间的延长，HIF-1α的表达出 现先增加，随后降低的趋势，且于缺氧后24 h表 达量最高；而上皮性标志蛋白E-cadherin的表达 随缺氧时间延长表达逐渐下调，间质性标志蛋白 vimentin表达逐渐上调，见图 3，差异有统计学意 义（P<0.05）。

A,C,E:normoxia control group; B,D,F:hypoxia group; C,D: HIF-1α expression (yellow);E,F: E-cadherin expression stained by DAPI(blue) and marked by cy-3(red) 图 2 缺氧对Siha细胞的形态学和上皮性标记E-cadherin表达的影响 Figure 2 Effect of hypoxia microenvironment on morphology and E-cadherin expression of Siha cells

图选项

图 3 Western blot检测缺氧对人宫颈SCC Siha细胞HIF- 1α、上皮性标记E-cadherin及间质性标记vimentin转录后蛋 白表达水平的影响 Figure 3 Effect of hypoxia microenvironment on expression of HIF-1α and EMT markers,E-cadherin and vimentin, detected by Western blot

图选项

经缺氧模拟剂CoCl₂处理后，HIF-1α mRNA的 相对表达量逐渐升高，随着化学缺氧导致的HIF- 1α的激活，缺氧环境下Siha细胞snail1/2 mRNA的 表达量逐渐升高，与HIF-1α呈正相关；且观察到 twist2的表达亦随着缺氧时间的延长表达上调，但 twist1 mRNA的表达与缺氧6 h后表达无差异，与缺 氧12 h后表达上调明显；但zeb1/2mRNA的相对表 达在常氧组、缺氧6 h组、缺氧12 h组比较差异无 明显统计学意义（P>0.05），见图 4。

*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001,compared with 0h group,changes of EMT markers expression under hypoxia microenvironment for 12 and 24h 图 4 实时定量PCR检测缺氧12、24h后EMT诱导因子 Snail、Twist、Zeb mRNA的表达变化 Figure 4 mRNA expression of EMT inducible factors, snail,twist and zeb,under hypoxia environment for 12 and 24h detected by qRT-PCR

图选项

恶性肿瘤在快速增殖过程中可致局部组织缺 氧，促使处于缺氧状态的肿瘤细胞发生一系列 适应性反应，如血管形成、能量供应等；另一 方面，缺氧状态下效应因子HIF-1α上调，进而与 其下游靶基因的缺氧反应元件（hypoxia response element，HRE）结合，启动下游基因的转录，包括血管内皮生长因子（VEGF）、葡萄糖转运体1 （GLUT1）、多耐药基因1（MDR1）、促红细胞 生成素、E-cadherin等基因，共同参与肿瘤的恶性 进展^[7]。2006年Erler团队的研究证实缺氧微环境可 上调赖氨酰化酶来促进人乳腺癌及头颈部肿瘤的 远处转移^[8]；同年，Krishnamachary等^[9]提出HIF- 1α可诱导肿瘤发生EMT从而促进其转移，且这一 作用是通过HIF-1α直接抑制E-cad的表达来实现 的。近来，在多种肿瘤的研究中发现，缺氧是肿 瘤细胞发生EMT，获得迁徙、侵袭、转移能力的 主要诱导因素之一。

CoCl₂作为一种常用的低氧模拟剂，其作用 机制是通过抑制脯氨酰羟化酶活性，从而起到稳 定HIF-1α的作用。根据本实验室前期研究成果及 参考文献^[10]，选定200 μmol/L的CoCl₂模拟细胞低 氧，可不影响细胞活力并避免细胞毒性的产生。 本研究结果显示，CoCl₂诱导的化学缺氧状态下， 人宫颈SCC Siha细胞迁徙、侵袭、转移能力增强， 不仅如此，处于缺氧微环境中的Siha细胞丧失了 上皮细胞特有的形态，而呈现出类似成纤维细胞 样的长梭形，排列也变得更为紊乱。此外，E-cad 的表达随着缺氧时间的延长逐渐降低，而间质性 标记Vimentin的表达随缺氧时间的延长逐渐增加， 提示缺氧可抑制Siha细胞的上皮表型，诱导Siha细 胞发生EMT，促进其侵袭性表型。在已知的EMT 诱导转录因子twsit、snail、slug、zeb中，本研究 结果显示，宫颈癌细胞缺氧状态下EMT诱导因子 twsit和snail上调，与缺氧时间呈正相关，推测HIF- 1α可能参与调控转录因子twsit和snail的表达，而在 前期研究中^{[11, 12]}，twsit和snail已被证实可诱导宫颈 癌细胞发生EMT导致肿瘤不良预后，提示缺氧诱 导宫颈癌Siha细胞发生EMT并增强其侵袭性表型的作用可能是缺氧微环境对EMT诱导因子的直接 调控作用导致的。

在其他肿瘤的研究中，HIF-1α直接调控EMT 诱导因子的现象已被证实。Yang等在研究人头颈 部肿瘤的恶性进展过程中发现，HIF-1α可直接结 合转录因子twist启动子区的缺氧反应原件调控其 表达，进而促使肿瘤的转移及恶性进展^[13]；此外， Zhang等^[14]在肝癌的研究中发现，HIF-1α通过靶向 snail启动子区的两个缺氧反应元件上调snail的表 达，诱导肝癌细胞发生上皮间质性转化，获得侵 袭性表型,这些结果很好地解释了HIF-1α诱导EMT 发生的机制。另一方面，亦有报道称HIF-1α可通 过TGF-β通路直接诱导EMT^[15]，而在本研究中，缺 氧微环境激活HIF-1α，上调EMT诱导因子twist和 snail表达，提示缺氧诱导人宫颈癌细胞发生EMT 并获得侵袭性表型可能是通过上调twist/snail发挥 作用的。

综上所述，缺氧微环境条件下HIF-1α激活诱 导EMT参与宫颈癌恶性进展，可能与其对EMT 诱导因子的直接调控相关，基于这一结果，针对 HIF-1α的深入研究将为宫颈癌的诊治提供新的思 路。