碱性成纤维细胞因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）与恶性脑胶质瘤具有密切的相关 性，bFGF在恶性胶质瘤中高表达，且表达水平 与胶质瘤的恶性程度和分级正相关^{[1, 2]}，本课题组 前期应用小分子RNA（siRNA）干扰的方法“沉 默”bFGF，结果表明降低bFGF表达水平可明显诱 导胶质瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖^{[3, 4]}，因此bFGF基因可作为胶质瘤基因治疗的一个良好 靶点。本研究拟采用体外LR重组法，构建携带靶 向bFGF基因的小分子干扰RNA重组腺病毒载体， 并应用Western blot方法验证其作用效果。

bFGF-siRNA的正义链为5′-CGAACUGGGCA GUAUAAACTT-3′，反义链为5′-GUUUAUACUGC CCAGUUCGTT-3′； 含bFGF-siRNA、U6启动子和 BglⅡ/EcoRⅠ酶切位点的pGenesil-1-bFGF-siRNA 的质粒（专利号：ZL200810053006.x）、腺病毒 穿梭质粒pGStrack、腺病毒骨架质粒pGSadeno购 自晶赛公司；大肠杆菌DH5α，HEK293细胞为本 室保存；T4 DNA连接酶及限制性内切酶均购自 Takara公司；LR克隆酶Ⅱ购自Invitrogen公司；脂 质体转染试剂Metafectence购自Biontex公司；质 粒提取试剂盒及病毒DNA 提取试剂盒购自中鼎公 司；Western blot所用抗体购自美国Santa Cruz公 司。

用BglⅡ/EcoRⅠ两步法双酶切 pGenesil-1-bFGF-siRNA及腺病毒穿梭质粒。1.0% 琼脂糖凝胶电泳回收所需片段，回收的目的基因 和穿梭质粒片段在T4 DNA连接酶作用下16℃连接 过夜。取10 μl连接产物转化大肠杆菌DH5α感受 态细胞，涂布于含Kana抗性（终浓度为50 mg/L） 的LB（Luria-Bertani）平板上，37℃恒温箱培养 过夜。从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种 于5 ml含Kana抗性的LB培养液中，37℃恒温摇床 （250 r/min）培养过夜。最后，提取质粒并做酶 切鉴定，命名为pGStrack-bFGF-siRNA。

pGStrack- bFGF-siRNA与腺 病毒骨架质粒pGSadeno在LR克隆酶Ⅱ作用下进行 LR体外重组反应，加入1 μl蛋白酶K，37℃反应 15 min，消化重组酶。将5 μl上步反应产物转化感 受态细胞DH5α，筛选在Amp抗性LB平板上生长的 菌落进行培养，提取质粒命名为pGSadeno-bFGFsiRNA 。最后用PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切进一步鉴 定正确的重组腺病毒质粒。

用PacⅠ酶切重组腺病毒 质粒，酚∶氯仿∶异戊醇抽提，乙醇沉淀，获得 线性化腺病毒DNA。用Metafectene脂质体转染试 剂，按DNA∶lipid=1∶3的比例对达到50%~70% 融合度的HEK293细胞进行转染，转染后24 h将 培养液更换为10%胎牛血清的完全培养液。转染 3 d后，每天观察细胞病变效应（cytopathic effect, CPE），当细胞有明显的CPE现象且有>50%脱壁 时，即收集细胞进行裂解收集病毒。

以相同密度同时接种 HEK293细胞，细胞融合度约为60%~70%时，更换 培养液，改为10%FBS DMEM培养液10~15 ml，加 入20~30 μl以上1.2.3步骤所得重组腺病毒，24~48 h 后观察，60%左右细胞变圆，出现CPE现象，轻轻 吹打收集细胞悬液，800 r/min 离心5 min，弃上清 液，获得细胞沉淀，以无菌磷酸盐缓冲液2 ml重 悬细胞沉淀，液氮及37℃水浴反复冻融3次，4℃ 5 000 r/min 离心20 min，收集上清液。

将上步所扩增的 重组腺病毒200 μl，用病毒DNA提取试剂盒提取 DNA，进行PCR反应，引物序列pGSadeno-f： 5′-GTTTTGGCACCAAAATCA-3′；bFGF-r：5′-A TACTGCCCAGTTCGTTTTTTGTC-3′；反应体系 为：10×PCR Buffer 2.5 μl，rTaq 0.25 μl，dNTP（2.5 mmol/L）1 μl，pGSadeno-f（10 μmol/L）0.5 μl， bFGF-r（10 μmol/L）0.5 μl，LB培养液1 μl，加双 蒸水至25 μl；反应条件：95℃ 2 min；95℃ 15 s， 55℃ 15 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，32个周期。

用微量全细胞病 变法检测病毒滴度，即HEK293细胞按104个/孔接 种于96孔板，每孔加液量200 μl，置培养箱培养 24 h。待测病毒用DMEM培养液稀释至1×10^-2、1× 10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7等稀释度。吸 弃上清液后，分别加入每个稀释度的病毒液体,每 孔200 μl，每种样本均做复孔，同时设DMEM培养 液作对照(不含腺病毒)。再置于37℃、5%CO2条件 下继续培养36~48 h，镜检观察CPE现象,按公式计 算病毒滴度PFU/ml=接种细胞数×稀释度×10/加入 的病毒体积。

细胞 分为正常对照组、空载体组和实验组。正常对照组 为加PBS处理组；空载体组为加入含有绿色荧光蛋 白的腺病毒（Ad-GFP）；实验组为加入重组腺病毒 rAd5-bFGF-siRNA转染组。转染72 h后，提取总蛋 白，BCA法进行蛋白浓度测定，蛋白上样量为40 g， 行SDS-PAGE电泳后转膜，将蛋白转移至PVDF 膜上，膜封闭液室温封闭1 h后，一抗4℃过夜， TBST洗膜后，二抗（1:5000）室温作用1h，TBST 再次洗膜后，ECL化学发光试剂盒显影。

穿梭质粒pGStrack-bFGF-siRNA经Bgl Ⅱ/EcoR Ⅰ双酶切，凝胶电泳可见克隆在约400 bp处有一特异性条带，与预期结果相同，见图 1。

M: Marker;1: objective band 图 1 Bgl Ⅱ /EcoRⅠ双酶切pGStrack-bFGF-SiRNA电泳图 Figure 1 Electrophoretogram of Bgl Ⅱ/EcoRⅠdouble digested pGStrack-bFGF-SiRNA

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腺病毒重组骨架质粒pGSadeno-bFGF-siRNA经 PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切，凝胶电泳可见一条约2.9 kb 的小条带（目的克隆）和大于10 kb的大条带（为腺病 毒载体），与预期结果相同，见图 2。

M: Marker; 1: objective band 图 2 PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切pGSadeno-bFGF-SiRNA电泳图 Figure 2 Electrophoretogram of PI-SceⅠ/I-CeuⅠdouble digested pGSadeno-bFGF-SiRNA

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鉴定PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，可 见在约400 bp处有一特异性条带，见图 3，符合预 期，说明重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA包装成功。

M: Marker; 1: objective band 图 3 PCR鉴定重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA电泳图 Figure 3 Electrophoretogram of PCR identification of recombinant adenovirus rAd5-bFGF-siRNA

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按1×10⁴个/孔293细胞接种腺病毒后36~48 h， 观察在10^-2、10^-3稀释度的样本中HEK293细胞出现 完全CPE现象：90%细胞变圆，10%细胞浮起，见 图 4。按上述公式计算，扩增所得腺病毒滴度约为 5×10⁸ PFU/ml，能满足实验需要。

A: normal HEK 293 cell morphology; B,C: HEK 293 cell morphology in rAd5-null-GFP and rAd5-bFGF-siRNA virus infection dope with 1×10-3 dilution under light microscopy,respectively 图 4 微量全细胞病变法测定重组腺病毒滴度 Figure 4 Recombinant adenovirus titer determined by tracing full cytopathic effect

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与正常对照组(PBS处理组)和空载体组(加入 Ad-GFP)相比，实验组胶质瘤U251细胞经转染 rAd5-bFGF-siRNA 72 h后，bFGF蛋白表达明显降 低，见图 5。

I: normal control group(PBS); II: empty vector group(Ad-GFP); III: experimental group(rAd5-bFGF-siRNA) 图 5 Western blot检测bFGF蛋白的表达情况 Figure 5 bFGF protein expression detected by Western blot

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bFGF基因定位于人染色体4q26-27，其编码 的蛋白是含155个氨基酸的促有丝分裂多肽，分子量为16~18.5 kD。bFGF不但能够强烈刺激神经外 胚层和胶质细胞有丝分裂，而且作为一种与肿瘤 相关的生长因子，能够促进恶性肿瘤细胞增殖和 血管生成，与基底细胞癌、食管癌、肺癌、脑胶 质瘤等关系密切^{[5, 6, 7]}。目前认为，bFGF通过与高亲 和力的跨膜酪氨酸激酶受体以及低亲和力FGFR受 体结合，激活多种信号转导通路，参与肿瘤的发 生发展，如Ras-Raf-MEK-MAPK、PI3K-AKT以及 JAK-STAT等^[8]。因此，通过抑制bFGF的表达间接 打断多个与肿瘤生长密切相关的信号通路不失为 一种新的靶向治疗选择。应用氢醌磺酸盐抑制FGF 基因表达成功治疗恶性脑胶质瘤已有报道^[9]，本研 究小组前期成功应用bFGF小分子干扰RNA诱导了 恶性脑胶质瘤细胞系的凋亡^{[3, 4]}，本研究用腺病毒 载体将bFGF-siRNA重组构建出rAd5-bFGF-siRNA 为下一步的胶质瘤基因治疗提供理想的工具。

RNA干扰即双链RNA在Dicer酶作用下加工裂 解为21~23核苷酸长的小分子干扰RNA，siRNA 片段结合核酶复合物，形成RNA诱导沉默复合物 (RISC)，激活的RISC通过碱基配对定位到同源 mRNA转录本上并将其剪切，从而破坏目的基因 转录产生的mRNA，沉默功能表型^{[10, 11]}。与基因替 代，反义寡核苷酸等传统的基因疗法相比，RNA 干扰具有高效特异等优点，为基因治疗开辟了新 的途径。本实验构建的bFGF-siRNA质粒即将优 选的bFGF-siRNA序列克隆至含有U6启动子和Bgl Ⅱ/EcoRⅠ酶切位点的质粒，然后得到pGenesil-1- bFGF-siRNA质粒，用于下一步与腺病毒穿梭质粒 pGStrack重组。

由于腺病毒载体具有转移效率高、安全性 好、靶细胞范围广、高滴度制备等优点，因此腺 病毒载体已成为基因治疗研究的首选工具。传统 的细胞内同源重组法由于重组率低、工作量大、 周期长等缺陷限制了其在研究中的应用。细菌内 重组法制备腺病毒的关键环节是同源重组，由于 转化条件的限制，筛选出正确的重组腺病毒质粒 阳性率只有20%。为进一步提高效率，我们采用 LR体外重组方法，将两个质粒先体外LR重组， 然后经酶切线性化转染HEK293细胞来制备重组 腺病毒。LR反应即attL入门克隆和attR目的载体 之间的重组反应，以便在平行反应中将目的序列 转移至一个或多个目的载体。本实验采用复制缺 陷型腺病毒构建系统，即以Ad5血清型E1/E3缺陷 型腺病毒DNA为骨架，这样便使穿梭载体和病毒 骨架载体都有了相应的改进，然后用酶切消化和 连接的方法将目的基因克隆至入门载体，即腺病 毒穿梭质粒pGStrack，然后腺病毒重组穿梭质粒 pGStrack-bFGF-siRNA与腺病毒骨架质粒pGSadeno 进行LR体外位点特异性重组。重组腺病毒rAd5- bFGF-siRNA成功构建之后，我们采用微量全细胞 病变法进行病毒滴度测定，结果显示病毒滴度较 高，完全满足后续实验需要。在转染恶性脑胶质 瘤实验中发现，rAd5-bFGF-siRNA能够成功诱导肿 瘤细胞的凋亡，增加对化疗药物的敏感度^[12]，证明 了此重组载体治疗脑胶质瘤的有效性。综上，本 研究采用LR体外重组法成功构建出携带有bFGFsiRNA 重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA为胶质瘤基因 治疗提高了一个重要工具。