微环境缺氧是实体肿瘤中普遍存在的现象之 一，并对肿瘤发生发展起到一定作用。肝癌的微 环境缺氧与肝癌对奥沙利铂耐药有何关系及机制 如何？本研究拟在观察肝癌耐奥沙利铂细胞系中 缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α）和多药耐药相关基因MDR1、MRP1和 BCRP的表达变化及其相互作用机制，从而为研究 逆转肝癌耐药提供新靶点。

肝癌细胞株（HepG2）购于中科院细胞研究 所；PCR扩增仪(ABI，美国ABI公司)、DMEM 培养液和胎牛血清（美国Gibco公司）、TRIzol 试剂盒（美国Invitrogen公司），M-MLV第一链 cDNA合成试剂（芬兰Ferment公司）。PCR扩增 试剂盒（上海生工生物公司）、兔抗人HIF-1α多 克隆抗体、兔抗人MDR1 、MRP1、BCRP多克隆 抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔和大鼠抗小鼠 抗体均购于北京中杉金桥、ECL发光试剂盒购自 Amersham公司。

人肝癌细胞株HepG2将其接种于含10%灭活 的胎牛血清的DMEM培养液中，置37℃、5% CO2 的培养箱中。采用浓度梯度诱导法，分别建立在 2.5、5.0 μg/ml HepG2/oxal奥沙利铂（oxaliplatin, oxal）浓度下稳定耐药的细胞株。

实验利用活性氧染料2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐 （2',7'-Dichlorodihyrofluorescin diacetate），进入细 胞后被水解形成具有极性的 （Dichlorodihyrofluorescin， DCFH），与细胞内产生的H2O2反应，生成具 有高荧光强度的DCF，用流式细胞仪检测到的DCF 荧光强度反应了细胞内ROS的水平。取对数生长期 肝癌细胞接种于6孔板中，实验分为：亲本细胞、 2.5、5.0 μg/ml HepG2/oxal 三个不同浓度组培养24 h 后加入终浓度为10 μmol/L DCFH-DA，空白组不加， 置培养箱中孵育30 min，然后收集细胞，PBS洗细胞 2次，各取200 μl PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测。

实验分组同上，收集细胞，用预冷的PBS洗涤 两次，2 500 r/min，5 min。调整细胞浓度为1×10⁵/ ml后，用Anexin-V和碘化丙啶（PI）双染15 min后 用流式细胞术检测细胞凋亡率。

取对数生长期细胞，实验分组同上；按照 Trizol试剂盒要求提取各组细胞总RNA，反转录成 cDNA。PCR反应体系为25 μl（上游引物1 μl，下游 引物1 μl，cDNA1 μl，2×Easy Taq Super Mix 12.5 μl, ddH2O 9.5 μl）引物序列根据GenBank序列由引物设 计软件设计，上海生工合成，见表 1。反应体系于 94℃变性35 s，退火35 s，72℃延伸30 s，共32个循 环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用Bio-Rad凝 胶成像并测定标本的灰度值。计算HIF-1α、耐药相 关基因与GAPDH的比值来判断HIF-1α、耐药相关 基因在不同耐药细胞系中的mRNA表达水平，结果 重复三次。

表 1 HIF及多药耐药基因引物 Table 1 Primer sequences of HIF and multidrug-resistance genes

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取对数生长期细胞，实验分组同上。提取各 组细胞总蛋白，用Brad-ford法测定总蛋白浓度。 取40 μl总蛋白提取液加入等体积2×SDS加样缓冲 液100℃水浴10 min，将总蛋白样本加入预制的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将目标分子量的 蛋白置于半干转膜仪转至硝酸纤维素膜上，5% 脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗4℃温育过夜。TBSTween20 缓冲液洗膜10 min ×3次。二抗室温温育 1 h。TBS-Tween20缓冲液洗膜10 min ×3次。加入 ECL液检测杂交信号，在Bio-Rad凝胶成像仪上成 像并进行密度分析，结果重复三次。

所用数据以x±s表示，应用SPSS10.0统计学软 件分析，采用方差分析及q检验，P<0.05为差异有 统计学意义。

结果显示亲本细胞、2.5和5.0 μg/ml HepG2/oxal 耐药亚系细胞ROS的平均荧光强度分别为（188.74 ±8.82），（105.38±5.19）和（67.84±7.46）。2.5和5.0 μg/ml HepG2/oxal耐药组ROS水平均比亲本细胞组 显著下降（P<0.01），见图 1。

A:parental cells;B: 2.5μg/ml HepG2/oxal drug resistance subline;C:5.0μg/ml HepG2/oxal drug resistance subline; DCFH: dichlorodihyrofluorescin 图 1 肝癌细胞HePG2内ROS平均荧光强度的变化 Figure 1 Reactive oxygen species(ROS) mean fluorescence intensity in HePG2 cells

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结果显示，与亲本细胞组（40.57±1.88）相比 2.5 μg/ml HepG2/oxal耐药组细胞（19.50±1.37）、5.0 μg/ml HepG2/oxal耐药组细胞（9.47±1.40）， 细胞凋亡明显减少，差异均有统计学意义（P ＜0.00001，F=235.67），见图 2。

A: parental cells; B: 2.5μg/ml HepG2/oxal drug resistance subline; C: 5.0μg/ml HepG2/ oxal drug resistance subline 图 2 肝癌细胞与耐药细胞凋亡率 Figure 2 Apoptosis rates of HepG2 cells and HePG2/oxal

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随着耐药浓度的增加HIF-1α、MDR1、MRP1、 BCRP各基因mRNA水平的转录逐渐增高，2.5和5.0 μg/ml HepG2/oxal组与亲本细胞组比较差异有统计 学意义（P<0.05），见图 3、表 2。

1: parental cells ; 2: 2.5μg/ml HepG2/oxal drug resistance subline; 3: 5.0 μg/ml HepG2/ oxal drug resistance subline 图 3 肝癌细胞HepG2相关基因mRNA的变化 Figure 3 mRNA change of HepG2 cells related genes

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表 2 肝癌细胞HepG2相关基因mRNA的表达量(n=3,x±s) Table 2 mRNA levels of HepG2 cells related genes(n=3,x±s)

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结果显示，随着耐药浓度的增加H I F -1α、 MDR1、MRP1、BCRP蛋白的表达水平逐渐增高， 2.5和5.0 μg/ml HepG2/oxal组与亲本细胞组比较差异 有统计学意义（P<0.05），见图 4、表 3。

图 4 肝癌细胞HepG2相关基因蛋白的变化 Figure 4 Protein change of HepG2 cells related genes

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表 3 肝癌细胞HepG2相关基因蛋白的表达量(n=3,x±s) Table 3 Protein levels of HepG2 cells related genes (n=3,x±s)

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近年来在肝癌的化疗方面的研究有了很大进 展，如Qin等^[1]在亚洲开展的临床多中心的含有奥 沙利铂化疗方案的对比研究，发现能够延长肝癌 患者的生存期。Zaanan等^[2]研究发现吉西他滨和奥 沙利铂方案在多中心临床试验中也证明了含奥沙 利铂的化疗法案在肝癌治疗中具有重要意义。

目前肝癌的化疗效果不佳，多药耐药是主要 原因之一。研究肝癌耐药的相关分子生物学机 制，了解肝癌化疗耐药的成因，寻找逆转肝癌耐 药的新方法，已经成为目前肝癌治疗领域的研究 重点之一。肿瘤耐药有内在性和获得性两种类 型，前者是肿瘤细胞原发性耐药，后者是肿瘤细 胞在反复接触药物的过程中获得的耐药，也为临 床上主要的耐药形式。肿瘤细胞耐药机制包括： 药物聚集降低、细胞内药物分布改变、细胞周期 失控、凋亡反应降低、基因损伤修复增加以及药 物靶标突变等^[3]。

局部微环境缺氧在许多实体瘤中是常见现象^[4]。 肿瘤细胞为了适应缺氧的环境；肿瘤细胞的基因 组、蛋白组会发生改变，会出现新的性状。许多 肿瘤细胞处于严重的缺氧微环境中，这是肿瘤预 后差，易产生放疗、化疗耐受性的重要原因之 一^[4]。本研究发现随着肝癌细胞对奥沙利铂耐药 浓度的升高，其ROS的含量逐渐降低；2.5μg/ml HepG2/oxal耐药组和 5.0 μg/ml HepG2/oxal耐药组 与亲本细胞组相比差异有统计学意义。奥沙利铂 作用于肝癌细胞使其微环境发生改变这可能是肝 癌对其耐药的原因之一，那么具体的分子机制如 何？

HIF-1α在缺氧条件下广泛存在于人和动物的 肿瘤细胞内，它是目前发现的唯一在特异性缺氧 状态下发挥活性的转录因子。Timothy等^[5]研究发 现组蛋白酶通过调控HIF-1α来调节肿瘤的耐药。 HIF-1α与MDR的关系主要是HIF-1α诱导药泵蛋白 的表达，药泵蛋白介导的药物外排机制是MDR形 成的一个最主要原因。目前已经发现的药泵蛋白 有许多，如P-gp、MRP和BCRP等。其中由MDR1 基因编码的P-gp与MDR的关系最为密切。MDR1 也是受HIF-1α调控的靶基因，HIF-1α可诱导MDR1 /P-gp的表达增加^[6]。研究表明HIF-1α除了可诱导 P-gp表达外，也可诱导MRP的表达增加。最近在 人肺腺癌细胞株A549研究中发现，HIF-1α、P-gp 及MRP在缺氧下比常氧下表达更高，HIF-1α、 P-gp 和MRP的表达呈明显相关性，且缺氧下肿瘤 细胞的耐药性增加^[7]。Yu-Lun Chen等^[8]在人非小细 胞肺癌细胞株中研究也发现HIF-1α和多药耐药蛋 白参与肺癌的耐药。

我们推测肝癌对奥沙利铂耐药的可能机制是 肝癌细胞缺氧导致其胞内ROS降低，ROS降低可 能引起缺氧诱导因子-1升高。HIF-1α升高引起耐 药相关基因的改变，导致药物的排除增加从而引 起对奥沙利铂的耐药。实验发现2.5 μg/ml HepG2/ oxal耐药组和5.0μg/ml HepG2/oxal耐药组与亲本细 胞组HepG2相比HIF-1α的含量具有明显的差异， 随着耐药浓度的增加，HIF-1α表达量逐渐增加， 且在mRNA和蛋白水平相一致。研究发现肝癌对 奥沙利铂耐药的细胞株中多药耐药相关MRP1基 因的表达随着耐药浓度的增加而增加，其mRNA 和蛋白表达水平相一致。研究发现多药耐药相关 MDR1/P-Gp基因表达增高与HIF-1α的表达增高具 有相关性，提示核转录因子HIF-1α可能促进细胞 内多药耐药相关MDR1/P-Gp基因表达，这与前面 报道的相一致。Comerford等^[9]已证实MDR1/P-Gp 基因是缺氧反应性基因，在该基因启动子上存在 着功能性的HRE结合域，这进一步从基因结构水 平提供了确凿的证据。这也证实了前面的假说 HIF-1α可能引起多药耐药相关基因的改变而导致 肿瘤的耐药这一机制在肝癌中也存在。

然而新的研究发现乳腺癌耐药蛋白BCRP也随 着耐药浓度的增加而增加且与HIF-1α也有相关性， 这和他人报道的不一致，说明HIF-1α可能还通过调节BCRP的表达来介导肝癌细胞对奥沙利铂的耐 药，这可能是其在肝癌中新的耐药机制之一。 肿瘤细胞的凋亡耐受也是其产生耐药的机制 之一。研究发现与亲本细胞（HepG2）相比2.5、 5.0 μg/ml HepG2/oxa耐药组细胞，细胞凋亡明显 减少，差异均有统计学意义（P＜0.01），说明肝 癌对奥沙利铂耐药存在凋亡耐受机制。肿瘤细胞 凋亡可分为p53依赖型和非p53依赖型。野生型p53 (WTp53) 的主要功能是控制细胞周期，促进细胞凋 亡，它具有抑制MDR1基因转录的作用。研究发现 HIF-1α能通过诱导抗凋亡蛋白IAP-2的表达并且抑 制促凋亡蛋白Bax的表达而抑制肿瘤细胞凋亡^[10]。研 究还发现HIF-1α可功能性地抑制myc的表达，解除 对p21的抑制，抑制细胞凋亡^[11]。那么推测肝癌对奥 沙利铂耐药中可能是因为耐药细胞HIF-1α表达的增 加，抑制了肿瘤细胞凋亡使其发生凋亡耐受，从而 使肝癌细胞获得耐药性，具体机制有待于进一步研 究。

综上所述，肝癌微环境缺氧是诱导其对奥沙 利铂产生耐药性的重要原因之一。肝癌对奥沙利 铂的耐药可能是局部微环境缺氧导致ROS较低， ROS降低引起HIF-1α的表达增加；从而引起耐药 相关基因MDR1、MRP1、BCRP的增加，导致肝 癌细胞对奥沙利铂排出增加。凋亡耐受也可能是 其对奥沙利铂耐药的另外一种机制。这为我们临 床治疗肝癌的化疗方案的选择和逆转肝癌对奥沙 利铂耐药提供了重要的理论基础。