鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）为 我国华南地区常见的恶性肿瘤之一，在临床治疗 中通常以放疗为主并辅以适当的化疗^[1]。因缺乏对 复发及转移的有效控制，传统的放化疗手段在提 高鼻咽癌患者生存率方面遇到了瓶颈，寻找新的 治疗手段及辅助药物显得刻不容缓。中药是一个 巨大的药物分子宝库，从中药中开发低毒高效的抗 恶性肿瘤药物一直是国内外的研究热点。佛手柑内 酯（Bergapten）为呋喃香豆素类天然产物，广泛 存在于植物界中，更是中药蛇床子^[2]、白芷^[3]、北 沙参^[4]及化橘红^[5]等主要有效成分之一。佛手柑内 酯运用于白癜风等皮肤病的临床治疗在国外已经 有几十年历史，而最近的研究发现其对乳腺癌细 胞具有抑制增殖并诱导凋亡的作用，但佛手柑内 酯对鼻咽癌细胞的作用鲜有报道，其诱导凋亡的具体机制更不明确。为了验证佛手柑内酯能诱导 鼻咽癌细胞发生凋亡，及进一步探讨其可能的机 制，进行了如下研究。

鼻咽癌细胞CNE-2及HONE-1均为广东医学 院生物化学与分子生物学教研室（研究所）长 期传代培养及规范冻存。RPMI1640培养液、 0.25%胰蛋白酶液、胎牛血清（FBS）及TRIzol 裂解液购自Invitrogen公司（美国）。二甲基乙砜 （DMSO）、佛手柑内酯及普通化学试剂均购于 阿拉丁（上海）。CCK-8细胞增殖毒性检测试剂 盒购自同仁化学研究所（日本），FastQuant反转 录试剂盒及RealMasterMix (SYBR Green)定量PCR 试剂盒购自宝生物公司（大连），BAX、BCL2、 STAT3及p-STAT3 (Y705)兔单抗购自CST公司（美 国），PVDF膜、ECL发光液购自Millipore公司 （美国），Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒与 JC-1线粒体电位检测试剂盒、Caspase-3活性检测 试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗、 RIPA裂解液、5×蛋白上样缓冲液购自碧云天生 物研究所（上海）。7500实时定量PCR为Applied Biosystems公司产品（美国），多功能酶标仪为 BioTek公司产品，垂直电泳系统、槽式转膜系 统及冷凝CCD成像系统为Bio-Rad公司产品（美 国），FACSCanto Ⅱ流式细胞分析仪为BD公司产 品（美国）。

CNE-2及HONE-1的完全培养液为含10% FBS、100 u/ml 青霉素、100 mg/L链霉素的 RPMI1640培养液。待细胞生长至单层密度为80% 时进行传代，用0.25%胰蛋白酶液消化3 min左右， 弃去消化液加入适量完全培养液吹打细胞培养 面，制得细胞悬液，并以5×10⁴/cm²重新接种，24 h 左右换液一次。

本实验每种细胞分4组：对照组为加入DMSO 处理48 h，浓度为每毫升培养液加入1 μl DMSO； 加药组为加入佛手柑内酯的DMSO溶液处理48 h， 其中加药组分三个浓度（1、10、100 μM），选定 依据见CCK-8法检测毒性。

将细胞接种于96孔培养板，加入终浓度分别在 0.1~1 mM的含佛手柑内酯培养液正常培养48 h，当 培养时间结束时，弃去原培养液，每孔加入含10% CCK-8的培养液，5% CO₂、37°C孵育2 h，酶标仪 检测各孔吸光度，扣除背景值后以对照组为基准 计算各药物浓度的抑制率，利用两点法计算半数 抑制浓度。

按1.3实验分组处理细胞，胰酶消化细胞后收 集，根据试剂盒说明书操作：离心弃上清并用PBS 洗涤细胞1次，同前弃尽上清液后，按每1×10⁵细 胞加入195 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞后， 加入5 μl Annexin V-FITC混匀，室温避光孵育10 min。离心弃上清液后，加入190 μl Annexin V-FITC 结合液重悬细胞，加入10 μl PI染液混匀后冰浴。 随即进行流式细胞分析仪检测，调整并收集每个 样品的前散射光（FSC）、侧散射光（SSC）、绿 光（Annexin V-FITC）和红光（PI）四个通道的 信号，并以FSC/SSC作散点图圈出主细胞群，再 以Annexin V-FITC/PI对主细胞群作图分出Annexin V-FITC阳性、PI阴性或阳性的凋亡细胞群（Q2与 Q3细胞群的和），得到每组细胞的凋亡率。

按1.3实验分组处理细胞，胰酶消化细胞后收 集，600 g离心5 min，弃上清液并用PBS洗涤细胞 1次，同前弃尽上清液后，按每2×10⁶细胞加入100 μl裂解液比例加入裂解液，冰浴裂解15 min，按 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3） 活性检测试剂盒说明书操作，检测各组样品 Caspase-3的活性。同时利用Bradford蛋白定量试 剂盒对各组样品裂解液进行蛋白定量分析，选用 对照组为参照，计算各组样品的Caspase-3相对活 性。

按1.3实验分组处理细胞，根据试剂盒说明书 操作：弃去原培养液，用PBS洗涤细胞2次，加入 配制好的1 ml JC-1染色工作液，37°C避光孵育20 min，弃上清液，用0.25%胰酶消化细胞，PBS洗 涤并重悬细胞。随即进行流式细胞分析仪检测， 调整并收集每个样品的前散射光（FSC）、侧散 射光（SSC）、绿光（JC-1 Green）和红光（JC-1 Red）四个通道的信号，并以FSC/SSC作散点图圈 出主细胞群，再以JC-1 Green/Red对主细胞群作图 分出JC-1 Green阳性、JC-1 Red阳性的高线粒体电 位细胞（Q2细胞群），JC-1 Green阳性、JC-1 Red 阴性的低线粒体电位细胞（Q3细胞群），利用Q3 与Q2的比值表示线粒体膜电位的高低。

按实验分组处理后，弃去原培养液，加入 TRIzol室温裂解5 min，每1 ml TRIzol裂解液加入0.2 ml氯仿，剧烈振摇30 s，静置5 min。4ºC 12 000 g离 心15 min，吸取上清液至新离心管中，加入等体积 的异丙醇，吹打均匀，静置10 min，4ºC 12 000 g离 心5 min，用含75%乙醇的DEPC水溶液洗涤RNA沉 淀，稍事干燥后，用DEPC水溶解RNA。测得浓度 后按FastQuant RT Kit (With gDNase)说明书操作， 进行反转录；按RealMasterMix (SYBR Green)说明 书操作（引物序列见表 1），在7500实时定量PCR 系统上，选用ddCt相对定量法进行检测分析，其中 选用对照组为参照，内参基因为β-actin，计算各目 标基因的相对mRNA表达量。

表 1 实时定量RT-PCR引物 Table 1 Primers of real-time RT-PCR

表选项

按实验分组处理后，弃去原培养液，PBS洗 2次，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，收集裂 解液，4ºC 12 000 g 离心15 min，收集上清液，按 BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，向上 清液加入体积量1/4的5×上样缓冲液，沸水浴10 min后，冰浴5 min。使用SDS-PAGE蛋白电泳系 统，上样量为50 μg总蛋白，电泳参数为10%分离 胶、5%浓缩胶，100 V电泳90 min至溴酚蓝指示剂 迁移至底部后，进行电转移，使用0.2 μm的PVDF 膜，300 mA冰浴电转90 min。电转结束后，膜使 用5%脱脂奶粉封闭30 min，TBST漂洗3次每次5 min，加入稀释的一抗工作液（按产品说明书稀释 配制），4ºC孵育过夜，TBST漂洗3次每次5 min， 加入稀释的二抗工作液（按产品说明书稀释配 制），室温孵育1 h，TBST漂洗3次每次5 min，加 入ECL发光液，置ChemiDoc XRS+成像系统中， 检测化学发光情况。条带采用Quantity One软件的 光密度分析，按以下公式计算目标基因的相对蛋白 表达量：相对蛋白表达量=（目标条带光密度_实验组 /内参条带光密度_实验组）/（目标条带光密度_对照组/内 参条带光密度_对照组）

STAT3蛋白Y705位点的磷酸化水平的计算公 式：磷酸化水平=（磷酸化蛋白条带光密度_实验组/总 蛋白相对表达量_实验组）/（磷酸化蛋白条带光密度_对照组/总蛋白相对表达量_对照组）

100 μM佛手柑内酯及20 μM STA-21分别作用 42 h后，在培养液中加入终浓度为10 ng/ml的人重 组白介素-6（interleukin-6,IL-6）共处理6 h，按1.8 测定BCL2基因及BAX基因的mRNA水平。

每次实验设3复孔，每组实验重复3次以上， 所得数据用SPSS19.0软件进行统计学分析；计量 资料用均值±标准差（x±s）表示，多组间比较采 用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验 或Dunnett T3检验，检验水平α = 0.05。

利用CCK-8法计算佛手柑内酯对体外培养的 人鼻咽癌细胞CNE-2作用48 h的半数抑制浓度为 （143.7±9.7） μM，HONE-1作用48 h的半数抑制 浓度为（73.4±7.2） μM。本实验选用的三个剂量 组48 h抑制率分别为：CNE-2细胞1 μM抑制率为 （4.6± 1.2）%，10 μM抑制率为（9.9±1.9）%， 100 μM抑制率为（37.9±3.1）%；HONE-1细胞1 μM抑制率为（9.5±2.2）%，10 μM抑制率为（20.1 ± 2.9）%，100 μM抑制率为（63.6±1.6）%。三 组浓度对两种鼻咽癌细胞的抑制率跨度明显且合 理，可满足后续实验要求。

佛手柑内酯作用48 h后，利用Annexin V-FITC/ PI法标记每组细胞后流式细胞分析仪检测。从典 型流式分布图和多次实验所得凋亡率柱状图可 知，加药处理的10 μM浓度组与100 μM浓度组的凋 亡率相对于对照组明显升高（P<0.05），见图 1。

*: P=0.021,**: P=0.002,***: P<0.001,compared with control group 图 1 Annexin V-FITC/PI法检测佛手柑内酯作用后CNE-2 和HONE-1细胞凋亡 Figure 1 Apoptosis of CNE-2 and HONE-1 cells treated with bergapten detected by Annexin V-FITC/PI

图选项

佛手柑内酯作用48 h后，检测各组Caspase-3的 活性。加药处理的三个浓度组（1、10、100 μM） 的Caspase-3活性较对照组明显升高（P<0.05）， 且呈浓度依赖性，见表 2。

表 2 佛手柑内酯作用后CNE - 2 和HONE - 1 细胞的 Caspase-3活性检测 Table 2 Caspase-3 activity assay of CNE-2 and HONE-1 cells treated with bergapten

表选项

佛手柑内酯作用48 h后，检测各组细胞线粒体 膜电位。从典型的细胞线粒体膜电位流式分布图 和多次实验所得Q3与Q2的比值柱状图可知，加药处理的三个浓度组（1、10、100 μM）的线粒体膜 电位相对于对照组明显降低（P<0.05），见图 2。

*: P<0.001,compared with control group 图 2 JC-1测定佛手柑内酯作用后CNE-2和HONE-1细胞线粒体膜电位 Figure 2 Mitochondrial membrane potential of CNE-2 and HONE-1 cells treated with bergapten detected by JC-1

图选项

佛手柑内酯作用48 h后，利用实时定量RTPCR 检测各组细胞中BAX和BCL2基因的mRNA水 平。随着浓度的升高，BAX基因的mRNA表达量上 升，BCL2基因mRNA表达量下降，其中加药处理 的10 μM浓度组和100 μM浓度组与对照组之间比 较差异有统计学意义（P<0.05），见图 3。

a: P=0.023; b: P=0.009; c: P=0.006; d: P<0.001; e: P=0.010; f: P=0.002; g,h: P<0.001,compared witn control group 图 3 佛手柑内酯作用后CNE-2 （A）和HONE-1（B）细胞的 BCL2家族BAX和BCL2基因的mRNA表达水平 Figure 3 mRNA expressions of BCL2 and BAX in CNE-2(A) and HONE-1(B) cells treated with bergapten

图选项

佛手柑内酯作用48 h后，利用Western blot分析 各组细胞中BAX和BCL2基因的蛋白表达水平，并 利用Quantity One软件进行光密度分析。与mRNA 表达水平的变化趋势相同，随着药物浓度的提 高，BAX基因的蛋白表达水平增高，BCL2基因的 蛋白表达水平降低，两组细胞中100 μM浓度组与 对照组之间的差异均有统计学意义（P<0.05）， 见图 4。

a:P=0.039;b:P=0.034;c:P=0.046;d:P=0.029;e:P=0.013;f:P<0.001,compared with control group 图 4 佛手柑内酯作用后CNE-2 （A）和HONE-1（B）细胞的BCL2家族部分基因的蛋白表达情况 Figure 4 Protein expression of BCL2 and BAX in CNE-2(A) and HONE-1(B) cells treated with bergapten

图选项

佛手柑内酯作用48 h后，利用Western blot分 析各组细胞中信号转导及转录激活因子-3（signal transducers and activators of transcription,STAT3） 蛋白表达水平与p-STAT3 （Y705）的蛋白磷酸 化水平，并利用Quantity One软件进行光密度 分析。各组间STAT的蛋白表达水平基本一致 （P>0.05），而随着药物浓度的提高，p-STAT3 （Y705）的磷酸化水平明显降低，两组细胞中加 药处理的10 μM浓度组和100 μM浓度组与对照组 之间比较差异均具有统计学意义（P<0.05），见 图 5。

a: P=0.041; b: P=0.01; c: P=0.013; d,e: P<0.001,compared with control group 图 5 佛手柑内酯作用后CNE-2（A） 和HONE-1（B）细胞的STAT3蛋白表达量及磷酸化水平 Figure 5 Protein expression of STAT3 and p-STAT3 (Y705) in CNE-2(A) and HONE-1(B) cells treated with bergapten

图选项

IL-6处理6 h，细胞中BCL2基因的mRNA水 平增加（P<0.05），BAX基因的mRNA水平降低 （P<0.05）。STAT3特异性抑制剂STA-21能显著 抑制IL-6诱导的BCL2基因（P<0.05）转录增加及 BAX基因（P<0.05）转录降低，同样佛手柑内酯也 能显著降低IL-6诱导的BCL2基因（P<0.05）及BAX 基因（P<0.05）的mRNA水平变化，见图 6。

*:P<0.001,compared with control group;**:P<0.001,compared with IL-6 (10ng/ml) group 图 6 佛手柑内酯、STA-21和IL-6对CNE-2（A）和HONE-1（B）细胞中BCL2 和 BAX mRNA的影响 Figure 6 The influence of bergapten,STA-21 and IL-6 on BCL2 and BAX mRNA expression in CNE-2 (A) and HONE-1 (B) cells

图选项

佛手柑内酯因具有平面共轭结构，最早与长波 紫外线（UVA）联用治疗白癜风等皮肤疾病。随后 研究发现佛手柑内酯在UVA的帮助下能与DNA的 腺嘌呤和胸腺嘧啶产生交联的相互作用^[6]，这种光 毒性能导致DNA的破坏，有诱发皮肤癌的风险^[7]， 但更为深入的临床研究却表明，佛手柑内酯制成适 合的制剂却具有保护皮肤免受紫外诱导的DNA损 伤^[8]。 Lee等^[9]研究证实，佛手柑内酯对人肝癌细 胞J5具有明显的体外抑制能力，作用机制可能包 括了直接杀伤作用、阻滞细胞周期作用及诱导细 胞凋亡作用等。这提示我们，佛手柑内酯可以作 为抗癌的天然小分子进行深入的研究，董芳等^[4]从 中药北沙参中分离出的佛手柑内酯，在体外抑制 肝癌母细胞与胃癌细胞生长的能力相差甚远，经 换算佛手柑内酯对肝癌母细胞HEP-G2的48 h半数 抑制浓度约为357.1 μM，而对胃癌细胞SGC-7901 的48 h半数抑制浓度约为4.0 μM，显示出不同肿瘤 细胞对佛手柑内酯的敏感度不同。因此，本实验 先利用CCK-8法测算出佛手柑内酯对两种鼻咽癌 细胞的体外抑制活性，其中CNE-2的48 h半数抑制 浓度为（143.7±9.7） μM，HONE-1作用48 h半数抑制浓度为(73.4±7.2) μM，结果显示佛手柑内酯 对鼻咽癌细胞的抑制活性较肝癌细胞好，但仍不 及胃癌细胞，而两种鼻咽癌细胞对佛手柑内酯的 敏感度亦不同，其中HONE-1较CNE-2更为敏感。

凋亡机制的异常与癌症的发生过程密切相 关，诱导癌细胞凋亡更是癌症治疗过程中的重要 机制，对鼻咽癌细胞具有诱导凋亡能力的小分子 化合物可有望成为临床放化疗治疗手段的辅助药 物。本实验利用Annexin V-FITC/PI双染法观察到 佛手柑内酯对低分化的CNE-2和高分化的HONE-1 均有诱导凋亡的作用，凋亡率随药物浓度的增 加而升高。同时，本实验还检测了各组细胞的 Caspase-3活性，结果显示佛手柑内酯能呈浓度依 赖性地增加各组细胞中Caspase-3的活性。活化的 Caspase-3能特异性剪切包括PARP在内的底物蛋 白，参与了染色质固缩、DNA片段化及细胞起泡 等凋亡特征性过程^[10]，进一步证明了佛手柑内酯 能诱导鼻咽癌细胞凋亡。此外Panno等^[11]通过实验 证明，佛手柑内酯能在体外有效抑制乳腺癌细胞 MCF-7和SKBR-3的增殖并诱导其凋亡，其机制与 佛手柑内酯激活caspase-8/-9使细胞DNA片段化并 诱导乳腺癌细胞凋亡有关，可见佛手柑内酯对多 种癌细胞均具有诱导凋亡的能力。

为了进一步阐明佛手柑内酯诱导鼻咽癌细胞 凋亡的相关机制，本实验利用JC-1荧光染料法检 测各组细胞线粒体的膜电位（ΔΨ）情况，结果显 示佛手柑内酯能呈浓度依赖性地降低鼻咽癌细胞 线粒体ΔΨ，表明线粒体膜的功能受损，其通透性 和完整性受到破坏，细胞色素C（cytochrome C） 等多种诱导凋亡的因子可能从线粒体内释放继而 引起细胞的凋亡。BCL2家族蛋白主要通过调节线 粒体的功能来调控细胞的凋亡，其中BCL2蛋白能 与BAX蛋白结合形成异源二聚体，阻碍BAX形成 同源二聚体，避免BAX同源二聚体在线粒体膜上 组成离子通道，保护了线粒体膜电位，并阻止细 胞色素C释放入胞浆所引发的关联Caspase活化^[12]。 故我们随后检测了BCL2家族成员中BCL2与BAX 的mRNA及蛋白表达水平，结果显示佛手柑内酯 能降低抑制凋亡的BCL2基因mRNA及蛋白的表达 量，同时增加促进凋亡的BAX基因mRNA及蛋白的 表达量，表明佛手柑内酯可能通过下调BCL2基因 及上调BAX基因破坏线粒体功能继而诱导鼻咽癌细 胞凋亡的发生。

Bose等^[13]发现佛手柑内酯能抑制肿瘤坏死因 子-α（tumor necrotic factor-α,TNF-α）和白介素-6 （interleukin-6,IL-6）这两个炎症因子的分泌。其 中IL-6与鼻咽癌的发生发展密切相关，IL-6可以通 过Janus激酶（JAK）磷酸化STAT3蛋白Tyr705及 Ser727位点，使STAT3二聚体化激活入核，增加 BCL2的表达并降低BAX的表达，保护鼻咽癌细胞 免于凋亡^[14]。是否佛手柑内酯通过抑制STAT3的活 性而影响了BCL2与BAX的表达？为了回答这一问 题，本实验对各组STAT3的蛋白表达量及p-STAT3 (Y705)的蛋白磷酸化水平进行了检测，结果显示 各组间STAT3的表达量并无显著差异，说明佛手柑 内酯对STAT3的表达量无影响，但p-STAT3 (Y705) 的蛋白磷酸化水平随着佛手柑内酯的含量增加而 降低，表明佛手柑内酯能抑制STAT3蛋白Tyr705的 磷酸化。同样，佛手柑内酯与STAT3选择性抑制剂 STA-21相同，能抑制IL-6诱导的BCL2表达增加及 BAX表达降低，STA-21被Song等^[15]证明能特异性 抑制STAT3的激活、抑制乳腺癌细胞的生长并诱导 其凋亡。虽然佛手柑内酯能抑制IL-6激活的STAT3 信号激活，但佛手柑内酯对JAK等激酶是否具有抑 制活性，仍需进一步探索。

在前人的研究基础上发现，佛手柑内酯对鼻 咽癌细胞CNE-2及HONE-1具有较为显著的体外 抑制活性及诱导凋亡能力，其诱导凋亡的机制与 破坏线粒体功能有关，并发现佛手柑内酯增加 BAX的表达及降低BCL2的表达同时抑制p-STAT3 (Y705)的蛋白磷酸化水平，揭示出佛手柑内酯具 备开发成鼻咽癌放化疗辅助药物的潜能，对佛手 柑内酯抗肿瘤机制的更深入研究，将有助于推动 佛手柑内酯在癌症治疗过程中的应用，并为进一 步的结构改造及剂型优化提供重要的理论依据。