新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy， NAC）在乳腺癌的综合治疗中发挥越来越多的作 用。虽然与传统的辅助化疗相比NAC不能改变乳 腺癌患者的总生存期（overall survival，OS）和无 疾病进展生存期（progression free survival，PFS）, 但研究已证实NAC可增加乳腺癌患者的保乳手术 （breast conserving surgery，BCS）率^[1]。获得病理 完全缓解（pCR）是接受NAC治疗的患者长期预 后良好的有力指标^[2,3,4]。研究发现不同亚型乳腺癌 的pCR率有很大差异，其中基底细胞类型（Basallike） 和HER2阳性表达的乳腺癌患者比腔细胞 样型（Luminal-like）和正常细胞样型（Normallike） 的患者对以紫杉类和蒽环类为主的化疗方 案更敏感^[5,6]。目前，尽管一些临床病理及分子指 标如激素受体（hormone receptor，HR）状态、 HER2的表达、肿瘤大小、淋巴结分期、组织学分 级和核分级以及应用基因芯片所做的基因分型可 以初步预测乳腺癌患者对NAC的反应^[7,8,9]，但目前 我们仍未能有效预测哪些患者将从NAC中受益， 特别是易发生耐药的HR阳性患者^[10]。

miRNAs是一类长约22 bp的单链小分子非编码 RNA，大量证据表明，miRNAs在人类肿瘤中多异常 表达，不同miRNAs表达谱与不同来源的人类肿瘤以 及同一肿瘤的不同表型和生物学特性相关^[10,11]。最近 的一些研究发现，人类血清和血浆中存在着一些异 常表达的miRNAs，或许可以成为肿瘤及其他疾病诊 断及治疗的一种新的无创性监测手段^[12,13,14]。

miR-221定位于X染色体上，通过靶向p27Kip1影 响癌细胞的增殖潜力^[15]。在乳腺癌中，miR-221可 以特异性靶向雌激素受体α（ERα）的3’-UTR，其 表达升高导致乳腺癌细胞对他莫昔芬的耐药^[16]。 另外，与MCF-7细胞相比，miR-221在阿霉素耐药 株MCF-7/ADR细胞表达显著升高^[17]。为了探讨血 浆中miR-221的表达是否可以作为接受NAC治疗 的乳腺癌患者对紫杉类和蒽环类药物治疗反应性 的预测指标，本研究采用从血浆中直接反转录和 PCR扩增的方法测定在中山大学孙逸仙纪念医院 乳腺肿瘤医学部接受NAC治疗的93例乳腺癌患者 和32名健康志愿者血浆中miR-221的表达，比较乳 腺癌患者与健康志愿者中miR-221的表达水平，同 时分析miR-221的表达与乳腺癌患者临床病理特征 和预后的关系。 1 资料与方法 1.1 资料 1.1.1 乳腺癌血标本

93例全血标本取自于2008年 10月—2010年4月在中山大学孙逸仙纪念医院乳腺 肿瘤医学部经粗针穿刺活检后确诊的Ⅰ~Ⅲ期非 转移性乳腺癌并拟接受以紫杉类和蒽环类为基础 的NAC治疗的乳腺癌患者。本项目通过中山大学 孙逸仙纪念医院医学研究伦理委员会的批准和许 可，所有研究对象均签署了在本研究中使用她们 血液样本的知情同意书。 1.1.2 健康志愿者

来源于同时期在中山大学孙 逸仙纪念医院乳腺肿瘤医学部接受乳腺普查并签 署了在本研究中使用她们血液样本知情同意书的 健康妇女。 1.2 方法 1.2.1 患者的治疗和评估

所有患者均接受了以 表柔比星（90 mg/m²）和多西紫杉醇（75 mg/m²） 或紫杉醇（150 mg/m²）为基础的每21 d为一周期 的NAC治疗，至少4个疗程；所有HER2阳性患者 均未在NAC治疗过程中接受赫赛汀治疗；所有患 者在化疗疗程结束后14~28 d接受手术治疗，并在 NAC治疗前后行超声检查其原发肿瘤的大小和腋 窝淋巴结情况；在接受NAC治疗前对所有患者的 原发肿瘤进行粗针穿刺活检，如果伴随临床可触 及的腋窝淋巴结肿大则同时行腋窝淋巴结穿刺活 检。应用RESCIST标准评估患者对治疗的反应： 完全缓解（CR：所有目标病灶完全消失）、部分 缓解（PR：基线病灶长径总和缩小≥30％）、疾 病稳定（SD：基线病灶长径总和缩小但未达PR或 增加未达PD）和疾病进展（PD：基线病灶长径 总和增加≥20％或出现新的病灶）。将pCR定义 为病理检测判定为治疗后原发部位无浸润性癌残 留。其中pCR和PR的患者被认为是NAC治疗有效 （overall response rate，ORR），而PD和SD的患者 视为对化疗耐药^[18]。

中山大学孙逸仙纪念医院病理科对治疗前原 发灶标本常规行免疫组织化学（IHC）检测ER、 PR、Ki-67以及拓扑异构酶Ⅱ（Topo Ⅱ）蛋白表达 情况，采用荧光原位杂交法（FISH）或IHC检测 HER2的表达。ER和PR阳性定义为≥10％肿瘤细 胞核内染色；HER2阳性标准为IHC(+++)或FISH阳 性；≥30％肿瘤细胞核染色被认为是Ki-67阳性， TopoⅡ阳性标准为≥10％肿瘤细胞核内染色；采 用Elston-Ellis核分级法对肿瘤进行核分级评估^[19]。 1.2.2 血标本的收集和制备

采集接受NAC治疗 前的患者以及健康志愿者的外周血5 ml，放置于含 肝素的抗凝管中。在采集后2 h内2 000 r/min离心 15 min分离成血浆和细胞成分，血浆储存在-80℃ 冰箱备用。 1.2.3 qRT-PCR检测

应用PrimeScript™反转录试 剂盒（Takara Bio Inc,Kyoto,Japan）直接对血浆标 本进行反转录合成cDNA。其中RT混合反应液如 下：5×PrimeScript缓冲液 4 μl；PrimeScript反转录 混合酶Ⅰ 1 μl；miR-221反转录引物（62.5 nmol） 2 μl；血浆 1 μl；DEPC水至总体积20 μl。miR-221 引物为： 5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACG AAA CC-3′。在PCR扩增仪进行RT反应，反应条件如 下：42℃ 15 min；85℃ 15 s；反应结束后，将合 成的cDNA样品用蒸馏水稀释至400 μl置于冰上待 用或-20℃保存，然后进行Real-time PCR反应。应 用Hairpin-it miRNAs荧光定量PCR试剂盒 (吉玛,中 国上海) 和罗氏LightCycler 480检测系统。20 μl体 系配制如下：miR-221正向和反向引物（5 μM）各 1 μl；cDNA产物 2 μl；Taq DNA聚合酶（5 u/μl） 0.2 μl；2×Real-time PCR缓冲液 10 μl；dNTP（2.5 mM）1 μl；加水至总体积为20 μl。miR-221的引 物为5′-CCG CAG CTA CAT CTG GCT ACT G-3′ 和 5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′ ^[20]。进行PCR反 应，扩增45个循环，每个循环包括95℃ 30 s和60℃ 1 min。设定统一的Ct阈值分析实验结果，取3次实 验的平均值。由于血浆中缺乏有效的对照，我们采 用健康者中位Ct值作为标准对照，患者和健康志愿 者血浆miR-221相对表达水平采用公式2^-ΔCt计算， 其中ΔCt= Ct_{患者或健康志愿者}- Ct_对照 ^[12]，分别计算乳腺癌 患者和健康志愿者血浆miR-221的表达。 1.3 统计学方法

采用卡方检验比较患者和健康志愿者miR-221 表达水平及与临床病理特征的关系。采用单因素 方差分析和多因素方差分析检测包括血浆miR-221 水平在内的多种临床病理特征对ORR的影响。P值 为双向性检验，检验水准为α＝0.05，所有数据采 用SPSS16.0和GraphPad Prism 5.01软件进行分析。 2 结果 2.1 乳腺癌患者的临床特征

本研究中93例患者的临床特征见表 1。所有 患者均接受了以蒽环类和紫杉类为基础的NAC治 疗。诊断时患者的中位年龄为47岁（25~73岁）。 多数患者为浸润性导管癌。一半以上的患者为T2 期同时伴有腋窝淋巴结阳性。大约1/5的患者伴有 脉管浸润，绝大多数患者HR阳性。治疗后大约 15％的患者达到pCR，整体有效率（ORR=pPR+ pCR）为84.94％。

表 1 93例乳腺癌患者的临床病理特征 Table 1 Clinicopathological characteristics of 93 breast cancer patients

表选项

比较乳腺癌患者和健康志愿者血浆miR-221的 表达水平，结果表明乳腺癌患者组血浆miR-221的平 均表达水平明显高于健康志愿者组[分别为（1.453± 0.065）、（1.114±0.093），P=0.007]，见图 1。

图 1 乳腺癌患者中血浆miR-221的表达 Figure 1 Plasma miR-221 expression levels in breast cancer (BC) patients

图选项

根据患者中位表达水平分为miR-221高表达组 和低表达组。血浆miR-221表达水平与患者临床病 理特征的关系，见表 2。结果显示血浆miR-221的 表达仅与患者HR状态显著相关（P=0.008），而 与其他临床病理特征如患者年龄、淋巴结状态、 HER2状态、Ki-67水平、TopoⅡ水平、病理类 型、组织学分级、肿瘤大小、脉管浸润等无关。 高miR-221表达组的患者倾向于HR表达阴性。

表 2 血浆miR-221的表达与患者临床病理特征的关系 Table 2 Correlation of clinicopathological characteristics with plasma miR-221 expression

Notes: Low: group with lower miR-221 expression than the median level；High:group with miR-221 expression equal to or higher than the median level

表选项

对miR-221高表达组和低表达组进行比较时发 现两组中ORR差异有统计学意义（P=0.044），但 pCR率差异无统计学意义，见表 3。进一步采用单 因素方差分析的方法来分析临床病理因素、血浆 miR-221表达水平与ORR的相关性，发现与ORR相 关的因素包括病理分级、HR状态、HER2表达、 Ki-67的表达、TopoⅡ水平和血浆miR-221的表达高 低，见表 4。多因素分析结果显示HR状态、HER2 表达、TopoⅡ水平和血浆miR-221的表达高低均为 独立的化疗反应预测因素。HR阳性、血浆miR-221 高表达、HER2阴性、TopoⅡ低表达的患者更易对 NAC治疗耐药，而Ki-67表达水平则未能作为独立 的NAC耐药预测指标，见表 5。

表 3 血浆miR-221的表达与治疗疗效的关系 Table 3 Relationship between plasma miR-221 expression and curative effects

Notes: ORR: overall response rate; ORR=pPR+pCR

表选项

表 4 单因素方差分析乳腺癌患者临床病理特征与ORR的 关系 Table 4 Univariate analysis of clinicopathological features and ORR in breast cancer patients

Notes: HR: hazard ratio; CI: confidence interval

表选项

表 5 应用多因素回归分析方法分析在单因素方差分析中与 ORR有显著相关的因素与ORR的相关性 Table 5 Multivariate logistic regression analysis of clinicopathological factors that related to ORR in univariate analysis and ORR in breast cancer patients

表选项

NAC在乳腺癌中的有效性已经在既往研究中得到证实^[2]。目前NAC已经广泛地用于对局部晚期 或早期乳腺癌患者的治疗。然而，乳腺癌是一种 异质性疾病，不同患者对治疗的反应存在显著差 异。一些患者在NAC治疗后可以达到pCR，然而 有些患者却表现出对化疗明显耐药。因此，为了 明确哪些患者可以从NAC中获益而哪些患者可以 避免不必要的NAC治疗从而制定有效合理的个体 化治疗方案，在治疗前预测每一位患者对NAC治 疗的反应性非常重要。

本研究采用Pu等^[20]之前报道的方法直接从乳 腺癌患者和健康志愿者血浆样品中反转录并进行PCR扩增检测miR-221的表达，结果证实应用该方 法可以高效快速地检测乳腺癌患者和健康志愿者 血浆中miR-221的表达。

miR-221作为一种癌基因在多种肿瘤如结直 肠癌和甲状腺乳头状癌中的表达明显增加^[20,21]。 同样，本研究通过比较乳腺癌患者和健康志愿 者之间miR-221的表达水平，表明乳腺癌患者 血浆miR-221的表达水平显著高于健康志愿者 （P=0.007）。尽管只有少量接受NAC治疗的患者 （93例）和健康志愿者（32例）被纳入本研究， 但数据亦表明在乳腺癌中miR-221是一种癌基因。 本研究通过分析血浆中miR-221的表达水平与乳腺 癌患者临床病理特征之间的关系，发现miR-221表 达水平与原发灶HR状况呈负相关（P=0.008）， 与下列研究结果一致。有研究发现miR-221在ER阴 性乳腺癌细胞株和原发肿瘤标本中高表达，提示 miR-221可能参与了ERα蛋白的负调控^[22]。还有研 究证实ERα可以抑制miR-221和miR-222的表达，因 此miR-221和ER之间或许存在一个负反馈环，可以 促使乳腺癌细胞从ER阳性向阴性的转化，从而有 利于增强乳腺癌细胞的增殖和迁移能力^[23]。尽管 有一些研究证实miR-221能够通过调控其靶基因如 p27Kip1的表达而促进肿瘤的生长、维持细胞的增 殖^[20,21]，但本研究中并没有观察到血浆miR-221表 达水平与其他临床病理因素如Ki-67的表达、肿瘤 大小、淋巴结状态之间的关系，因此本研究仍未 能明确miR-221表达水平与乳腺癌增殖和转移能力 之间的关系。

本研究结果发现，血浆miR-221的表达水平与 ORR有关，但与pCR无关，因此miR-221表达增高 可以作为预测乳腺癌患者对NAC治疗耐药的一项 预测指标。虽然miR-221的表达水平与HR的表达呈 负相关，但本研究应用单因素和多因素Cox回归分 析的方法证实血浆中miR-221的表达水平是不依赖 HR状态的一个独立的预测化疗耐药的因子。在前 期研究中发现与亲本MCF-7细胞株相比miR-221在 阿霉素耐药株MCF-7/ADR中表达显著升高^[18]，结 合目前研究结果，提示miR-221可能是紫杉类和蒽 环类耐药的有效预测指标。此外，在Rao等^[24]研究 中发现miR-221/222过度表达通过调节多种信号通 路导致乳腺癌对氟维司群耐药。综合这些数据， 推测miR-221可以作为一个有希望的治疗靶点来治 疗对选择性雌激素受体调节剂或化疗耐药的乳腺 癌患者。

与其他研究结果一致的是，多因素回归分析中同样发现其他因素如HR状况、HER2状态和TopoⅡ 的表达水平等都是对NAC治疗耐药的独立预测因 素^{[25,26,27,28]}。尽管其他研究结果表明Ki-67同样作为一个 有效的预测NAC反应的指标，但本研究中未能证实 Ki-67为独立的NAC耐药的预测指标^[29,30]，这种差 异可能是由于对Ki-67表达水平的界定以及本研究 中样本量较小有关。

本研究尚存在一定的局限性。首先，由于种 种原因限制，纳入的乳腺癌患者和健康志愿者的 样本量较小，需要扩大样本量进一步验证。其 次，该研究仅是一项单中心的回顾性研究。第 三，由于血浆中缺乏明确的对照，本研究只能根 据健康志愿者的中位表达水平计算患者和健康志 愿者血浆miR-221的相对表达水平，并且未能建立 一个确切的界值，因此，在进一步的研究中需要 确定一个敏感度和特异性较高的miR-221值，从而 才有可能真正进入到临床应用。

本研究表明，与健康志愿者相比乳腺癌患者 血浆中miR-221的表达增加，同时miR-221的表达 水平与乳腺癌患者HR的表达呈负相关，miR-221 表达增高的患者易出现对紫杉类和蒽环类为主 的NAC治疗耐药。基于本研究结果，认为血浆 miR-221表达水平可能作为一个预测乳腺癌对NAC 治疗反应的指标。然而，仍需要更多研究来进一 步证实miR-221在接受NAC治疗前的应用价值。

（致谢：该研究所需标本及病例资料来源于 中山大学孙逸仙纪念医院乳腺肿瘤中心，在此表 示感谢。）