肿瘤防治研究  2014, Vol. 41 Issue (10): 1078-1081
本刊由国家卫生和计划生育委员会主管，湖北省卫生厅、中国抗癌协会、湖北省肿瘤医院主办。
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文章信息

扎拉嘎胡，刘英富，兰晓霞，陈小义. 2014.
ZHALA Gahu, LIU Yingfu, LAN Xiaoxia, CHEN Xiaoyi. 2014.
蟾蜍灵对B16细胞增殖及凋亡的影响
Effects of Bufalin on Proliferation and Apoptosis of Melanoma Cells B16
肿瘤防治研究, 2014, 41(10): 1078-1081
Cancer Research on Prevention and Treatment, 2014, 41(10): 1078-1081
http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2014.10.005

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收稿日期：2013-07-29
修回日期：2013-10-30
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引用本文
扎拉嘎胡，刘英富，兰晓霞，陈小义. 蟾蜍灵对B16细胞增殖及凋亡的影响[J]. 肿瘤防治研究, 2014, 41(10): 1078-1081.
ZHALA Gahu, LIU Yingfu, LAN Xiaoxia, CHEN Xiaoyi. Effects of Bufalin on Proliferation and Apoptosis of Melanoma Cells B16. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2014, 41(10): 1078-1081.
蟾蜍灵对B16细胞增殖及凋亡的影响
扎拉嘎胡1, 刘英富1, 兰晓霞2, 陈小义1    
1. 300162 天津，武警后勤学院临床医学系 细胞生物学教研室;
2. 救援医学系流行病与统计学教研室
收稿日期：2013-07-29；修回日期：2013-10-30
基金项目：武警医学院院级资助项目（WYM201104,WHM201209）
作者简介: 扎拉嘎胡（1972-），女，硕士，讲师，主 要从事中药治疗肿瘤研究
通信作者：陈小义，E-mail：chenxiaoyi6111@163.com
摘要：目的 研究中药蟾蜍灵对B16细胞增殖和凋亡的影响，探讨蟾蜍灵对黑色素瘤的抑制作用。方法 采用MTT法测定蟾蜍灵对B16细胞活力的影响；Hoechst 33342荧光染色检测细胞形态学变化； 流式细胞术检测蟾蜍灵对细胞周期的影响。结果 蟾蜍灵对B16细胞的增殖有抑制作用，且呈浓度和 时间的依赖性。蟾蜍灵作用24、48和72 h的IC50值分别为37.80、6.00和9.12 μmol/L。荧光染色显示蟾 蜍灵作用于B16细胞24 h后，细胞呈现典型的凋亡形态特征；细胞周期分析显示，蟾蜍灵处理组S期细 胞降低，蟾蜍灵可引B16细胞G0/G1期阻滞，而对G0/G1期阻滞随作用时间延长而增强。结论 蟾蜍灵 可能通过阻滞B16细胞增殖周期进程而诱导凋亡。
关键词： 蟾蜍灵     黑色素瘤细胞B16     细胞凋亡    
Effects of Bufalin on Proliferation and Apoptosis of Melanoma Cells B16
ZHALA Gahu1, LIU Yingfu1, LAN Xiaoxia2, CHEN Xiaoyi1    
1.Department of Cell Biology, Logistic College of CAPF, Tianjin 300162,China;
2. Department of Army Epidemiology and Statistic
Abstract：Objective To investigate the effect of bufalin on the proliferation and apoptosis of melanoma cells B16, and explore its inhibitory action on melanoma. Methods The effects of bufalin on the proliferation of melanoma cells B16 were detected by MTT. The morphological changes of the cells was observed by fluorescence staining with Hoechst 33342. Cell cycles were detected by flow cytometry. Results Bufalin significantly inhibited the proliferation of melanoma cells B16 in a time- and dose-dependent manner. IC50 were 37.80, 6.00 and 9.12 μmol/L respectively after 24, 48 and 72 h co-culturing with bufalin. Typical morphological characteristics of apoptosis were shown by fluorescence staining after 24 h. Investigation of cell cycles indicated that the S-stage cells were remarkably reduced, and cell cycles were arrested at G0/G1 in a time-dependent manner. Conclusion Bufalin could induce cell apoptosis by arresting cell cycles of melanoma cells B16.
Key words: Bufalin     Melanoma cells B16     Cell apoptosis    
0 引言

恶性黑色素瘤发病增长率呈逐年上升的趋 势，它转移早、进展快、预后差、死亡率高，至 今还没有治疗黑色素瘤的特效药。近年来大量的 实验研究表明，多种中药具有抗肿瘤和诱导肿瘤 细胞调亡的作用。蟾蜍是我国传统的中药材，很 早就有蟾蜍全虫或蟾酥内服及外用治疗瘸瘕积 聚、痰注、恶疮等类似肿瘤疾病的记载。蟾蜍灵 (Bufalin，二羟蟾毒二烯酸内脂)是从中药蟾酥中提 取的一种毒性配基，研究证明，蟾蜍灵在体外对 人白血病、胃癌[1, 2]及肝癌细胞生长均具有抑制作 用。蟾蜍灵可以明显抑制前列腺癌细胞株DU145、 LNCaP和PC3的增殖，并促进其发生凋亡[3, 4, 5]。我们 课题组前期研究也发现Bufalin具有抑制体外培养 癌细胞系的增殖和促进其凋亡作用[6, 7]。本实验旨 在研究Bufalin对B16细胞生长、细胞周期及凋亡的 影响。 1 材料与方法 1.1 主要试剂

B16细胞购自中国科学院上海细胞生物研究 所。RPMI1640培养液购自美国Gibco公司，胎牛 血清购自民海生物公司，胰蛋白酶（1 ：250）购 自美国Gibco公司，蟾蜍灵（Bufalin）、碘化丙啶 （PI）、噻唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO） 均购自Sigma公司，5410 CO2培养箱购自美国Napco 公司，SW-CZ-ZFO超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司，SUNRISE全自动酶标仪购自奥地 利Tecam公司。 1.2 MTT法检测Bufalin作用后B16生长抑制率

取对数生长期B16细胞用0.25%胰酶消化制成5× 104 cells/ml细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μl，常 规培养24 h，待细胞70%~80%汇合后，药物处理。 实验组分别加入Bufalin 0.1、1、10、100 μmol/L， 同时设正常对照组（有细胞不加药）和空白对照组 （只有培养液，不加细胞），作用24、48和72 h后， 加入MTT 20 μl（终浓度5 g/L），继续培养4 h，1 500 g 离心10 min，弃上清液，每孔加150 μl DMSO，避光振荡 混匀，酶标仪测定（Bio-Rad 550型）其A490值。按公式 计算细胞生长抑制率：抑制率（%）=(A正常对照-A实验)/ (A正常对照-A空白对照)×100%。数据采用加权直线线性回 归法求得细胞生长抑制率为50%时的药物浓度。 1.3 荧光显微镜观察细胞凋亡

设实验组和对照组，实验组为取对数生长的细 胞加入2 μmol/L Bufalin作用24、48 h。对照组不加 药。细胞消化离心收集细胞，PBS洗涤2次后重悬 于200 μl PBS中，加入20 μl Hoechst33342(终浓度10 μg/ml)，在37℃培养箱中染色10 min，1 000 r/min离 心10 min，弃上清液，加入适量PBS，吹打混匀，滴 片，在荧光显微镜下观察细胞染色质凝集形态。 1.4 流式细胞术检测细胞周期

取对数生长期的B16细胞传代培养24 h后加药 处理，实验组分别加入1、2 μmol/L的Bufalin作用 24、48 h。对照组不加药。用0.25%胰蛋白酶消化 后，用预冷PBS洗涤，收集1×106个细胞，制成单 细胞悬液，4℃预冷的75%乙醇4℃固定过夜。加入 PBS离心洗2次后，加入碘化丙啶（PI）100 μg/ml （含Rnase终浓度为50 μg/ml），4℃避光染色30 min，进行流式细胞仪检测细胞周期各时相细胞 比率，并计算细胞增殖指数（proliferation index， PI），PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。 1.5 统计学方法

数据用x±s表示，采用SPSS13.0软件进行单 因素方差分析（ANOVA）和析因方差分析，以P ＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 Bufalin作用后倒置荧光显微镜观察细胞形态

对照组细胞生长饱满，透光性好，2 μmol/L Bufalin作用24 h后细胞折光性变差、48 h后细胞明 显肿胀，细胞表面变得粗糙，培养液中出现死亡 的漂浮细胞，见图 1。

A: control group; B: 2μmol/L 24h Bufalin group; C: 2μmol/L 48h Bufalin grouP＜/span> 图 1 Bufalin作用B16细胞后形态变化( ×100) Figure 1 The morphological changes of melanoma cells B16 treated with Bufalin ( ×100)
图选项
2.2 Bufalin对B16细胞增殖的影响

采用MTT评价不同浓度的Bufalin（F=399.826， P＜0.01）和作用时间（F=38.293，P＜0.01）比较均 有统计学意义，LSD法进一步两两比较结果显示， Bufalin同浓度不同时间差异显著（P＜0.01），在24 h 内有抑制效果，48 h最强，到72 h时抑制效果降低。 100 μmol/L与10 μmol/L、10 μmol/L与1 μmol/L间 差别无统计学意义（P>0.05），其余各浓度组间差 异均有统计学意义（P＜0.01）。72 h时0.1 μmol/L 浓度抑制率可达16.4%，而10 μmol/L浓度抑制率达 50.73%。24、48、72 h的IC50值分别为37.80、6.00、 9.12 μmol/L。综合析因方差分析结果显示：Bufalin 浓度为10 μmol/L、作用48 h，对B16细胞抑制效果 最强，见表 1。

表 1 Bufalin对B16细胞增殖的抑制（x±s, n=6） Table 1 Inhibitory effects of Bufalin on melanoma cells B16 (x±s, n=6)
Notes: *: P＜0.01, comparison at the different time points; a, b, c and d: P>0.05, comparison at the different concentrations, between the same alphabets, P＜0.01, between the different alphabets
表选项
2.3 荧光显微镜观察Bufalin促进B16细胞凋亡

Hoechst33342染色后荧光显微镜观察，对照 组细胞形态规整，细胞核均匀。实验组1 μmol/L Bufalin作用24 h，部分细胞呈现形态不规则、细胞 核固缩，核染色质凝集、细胞膜肿胀、边缘化、 产生凋亡小体，呈凋亡细胞形态；Bufalin对B16细 胞凋亡具有浓度和时间依赖性，见图 2。

A: control group; B: 1μmol/L 24h Bufalin group; C: 2μmol/L 24h Bufalin group; D: 1μmol/L 48h Bufalin group; E: 2μmol/L 48h Bufalin group; F: 2μmol/L 72h Bufalin grouP＜/span> 图 2 荧光显微镜观察细胞形态改变( ×200) Figure 2 Morphological changes of B16 melanoma cells under fluorescence microscopy( ×200)
图选项
2.4 流式细胞术检测细胞周期

与对照组相比Bufalin组可引起B16细胞G0/G1期 阻滞。1 μmol/L Bufalin作用48h后培养细胞中G0/G1 期细胞比例由（74.5±0.25）%增加到（83.6±0.16）%（P＜ 0.01）。Bufalin对G0/G1期阻滞随作用时间延长 而增强。比较细胞增殖指数（PI）发现Bufalin干预 后与对照组比较48 h降低，见表 2，图 3。

表 2 Bufalin对B16细胞周期分布的影响(x±s, %) Table 2 Effects of Bufalin on cell cycles distribution of melanoma cells B16 (x±s, %)
Notes: *: P＜0.05, compared with the control group, with LSD method
表选项
A, D: control group; B: 24h 1μmol/L Bufalin group; C: 24h 2μmol/L Bufalin group; E: 48h 1μmol/L Bufalin group; F: 48h 2μmol/L Bufalin grouP＜/span> 图 3 Bufalin对B16细胞作用后流式检测细胞周期 Figure 3 Cell cycle of melanoma cell B16 treated with Bufalin analyzed by flow cytometry
图选项
3 讨论

中药及其有效成分因其价格低廉、来源广 泛、应用历史悠久等优点在肿瘤防治方面的作用 越来越受到人们的重视。蟾蜍作为我国传统中药 之一，在治疗白血病及胃癌、肝癌、结肠癌等多 种消化系统肿瘤中得到了临床运用。Bufalin是从 蟾蜍中分离提取的抗癌有效单体，近年来更是得 到广泛研究，国内外研究已证实，中药蟾蜍灵具 有明显抑制肿瘤增殖的作用[8, 9]，它能通过多种途 径诱导肿瘤细胞分化和凋亡[10, 11, 12]，对白血病细胞 有极强的抑制作用[13]，对人绒膜癌、乳腺癌、肺 癌、结肠癌、血管内皮细胞也有增殖抑制和凋亡 的作用[14, 15, 16, 17, 18, 19]。

本研究通过检测Bufalin对B16细胞增殖和凋亡 作用发现，Bufalin可抑制B16细胞的增殖，其抑 制作用与作用时间及作用浓度相关，同时研究结 果还表明Bufalin可诱导B16细胞凋亡，此作用存 在剂量效应依赖性。荧光染色观察显示2 μmol/L Bufalin作用24 h后，可诱导B16细胞产生凋亡。流 式检测细胞周期发现Bufalin对B16细胞G0/G1期阻 滞。Bufalin 对B16细胞具有抑制增殖及促进凋 亡作用，此作用是Bufalin抑制B16细胞增殖并诱 导其凋亡的机制之一，从而发挥Bufalin的抗肿 瘤作用。

综上所述，本试验证明了Bufalin对B16细胞的 增殖抑制及诱导凋亡能力，为Bufalin的临床应用 提供了实验依据，Bufalin在黑色素瘤的治疗方面 是一种有应用前景的抗肿瘤药物。

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