大肠癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤，其 发病率近年来呈逐年上升趋势，在我国已居恶性 肿瘤发病率的第3位^[1]。大肠癌治疗早期以手术治 疗为主，但对于晚期及术后复发转移的患者化疗 仍为主要治疗方法^[2]。以5-Fu为基础的FOLFOX、 FOLFIRI方案为晚期大肠癌常用国际标准化疗方 案，但是肿瘤细胞对这些高选择、多靶点的化疗药 存在多药耐药性，肿瘤细胞的多药耐药是化疗失败 的主要原因。因此寻找高效低毒的多药耐药逆转剂 是当前肿瘤化疗亟待解决的难题。膈下逐瘀汤出自 清代王清任《医林改错》，具有活血化瘀，行气止 痛之功。现代研究表明，膈下逐瘀汤能够抑制肿瘤 细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡、提高抑瘤率、提高 肿瘤晚期患者生活质量的作用^{[3, 4, 5]}。本实验通过建 立耐药性稳定的HCT-8/5-Fu裸鼠移植瘤模型，观察 膈下逐瘀汤对耐药移植瘤MDR-1 mRNA的表达， 为膈下逐瘀汤逆转恶性肿瘤耐药，提高化疗效果提 供客观依据。 1 材料与方法 1.1 细胞培养

人结肠腺癌细胞HCT-8/5-Fu、HCT-8细胞购买 于南京凯基生物科技发展有限公司。 1.2 实验动物

BALB/C-nu/nu裸小鼠（4~6周），雄性，体质 量17~21 g，共28只，购于上海斯莱克实验动物有限 公司，合格证号：SCXK(沪)2012-0002。饲养于福 建中医药大学实验动物中心屏障环境，饲料、饮水 机垫料、笼具均经高压蒸汽灭菌后使用。 1.3 实验药物

膈下逐瘀汤主方组成为:五灵脂、当归、牡 丹皮、赤芍、乌药、延胡索、甘草、香附、红 花、枳壳、川芎、桃仁等纯中药材，购于福建 省立医院，按照常规煎药方法水煎两次，合并 两次水煎药，浓缩至1 g/ml中药浓缩液。氟尿 嘧啶（5-Fu）、长春新碱（VCR）、依托泊苷 （VP-16）、顺铂（DDP）均购于福建省立医院。 1.4 实验试剂

RPMI 1640培养液、胰蛋白酶、胎牛血清、 MTT液购于美国Gibco公司。RT-PCR试剂盒购 于日本TaKaRa公司。MDR-1、β-actin引物由 GenBank数据库中获得基因序列：MDR1基因引 物序列为（扩增产物大小为：144 bp）：上游引 物 5'-TCGCTGCTATTATCCATGGAACATT-3’， 下游引物5'-TGCTGATGATCAGAGTACTGTTGGG- 3 ’ ，内参照β - a c t i n 引物序列为（ 扩增 产物大小为：157 bp）：上游引物5' -GAGAGGGAAAATCGTGCGTGACA- 3’，下游引物 5'-ACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAAC-3’。 1.5 实验方法 1.5.1 细胞培养

将人结肠腺癌耐药细胞HCT-8/5-Fu、敏感细 胞HCT-8用RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清、 100 u/ml青霉素、100 μg/ml的链霉素)常规细胞培 养。耐药培养体系中加入终浓度为2.0 mg/L的5-Fu 以维持耐药细胞的耐药性。皮下接种前2周，耐药 细胞停用5-Fu，进行常规细胞培养。 1.5.2 MTT检测细胞耐药性

取对数生长期贴壁细胞 HCT-8、HCT-8/5-Fu， 0.25%胰酶消化、离心后，经细胞计数板计数后调 至1×10⁵/ml的细胞悬液。接种于96孔培养板中，每 孔加入100 μl上述细胞悬液，孵育24 h后分别加入 5种不同浓度的VCR、5-Fu、DDP、VP-16四组化 疗药，每种化疗药设5个复孔，设不加化疗药物的 实验对照组和不加细胞的空白对照组。再次孵育 24 h，弃上清液，每孔再次加入10 μl 5 mg/ml MTT 液，孵育4 h。弃上清液，每孔加入100 μl DMSO， 均匀振荡10 min。用酶联仪OD570 nm处测各孔的 吸光值。计算抑制率、耐药倍数。SPSS16.0计算 药物半数抑制浓度（IC₅₀），抑制率(%)=（对照组 OD值－实验组OD值）/对照组OD值×100%，耐药 倍数=耐药细胞IC₅₀/敏感细胞IC₅₀。 1.5.3 裸鼠移植瘤模型的建立及给药

将对数生长期HCT-8/5-Fu细胞4×10⁷/ml接种 于28只裸小鼠右腋下，12天后，肿块平均体积为 100 mm³，将上述裸鼠随机分为四组：对照组、 5-Fu组、膈下逐瘀汤组、膈下逐瘀汤+5-Fu组，四 组均每天给药1次，连续给药14天后颈椎脱臼处 死裸鼠，给药剂量及途径，见表 1。接种后第3、 6、9、12天、给药后第3、6、9、12天及处死，当 天用游标卡尺测量每组裸鼠移植瘤长径(a)、短径 (b)，计算瘤体体积。肿瘤体积计算：V=a×b²/2。 末次给药24 h后，剥离瘤体组织。称瘤重，计算抑 瘤率。抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重-实验组 平均瘤重）／对照组平均瘤重×100%。

表 1 各组给药方案 Table 1 Dosage regimen in each group

Notes: DSED: diaphragmatic sstasis expelling decoction

表选项

用 Trizol法提取移植瘤总RNA。内参照采用β-actin基 因，引物为根据Gibco公司说明书配置20 μl的反应 体系。采用1 μl进行PCR扩增。扩增条件为95℃预 变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延 伸30 s，共35个循环，72℃再延伸5 min。扩增产物 大小为144 bp。取PCR扩增产物上样于2%琼脂糖凝 胶电泳（80V，3 min）。凝胶图像系统扫描成像， 扩增条带用Quantity One软件分析，用MDR-1与 β-actin灰度比值表示MDR-1基因表达水平。 1.6 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析，计量资料用 均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方 差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 耐药细胞HCT-8/5-Fu多药耐药性的确立

HCT-8/5-Fu细胞株具有多药耐药特性，5-Fu对 耐药细胞的耐药倍数41.94。见表 2。同时该耐药细 胞对结果不同、机制各异的化疗药VCR、DDP和 VP-16均产生不同程度的耐药性。符合肿瘤细胞对 一种化疗药产生耐药性后，对机制不同、结构各 异其他化疗药产生交叉耐药的特性。

表 2 HCT-8、HCT-8/5-Fu组细胞对化疗药物的敏感度(x±s) Table 2 Sensitivity to chemotherapy drugs in two groups(x±s)

表选项

裸鼠右腋下接种HCT-8/5-Fu，观察裸鼠接种部 位变化。刚接种时裸鼠接种部位肿胀，第三天可 看到米粒大小的小结节、质硬、可移动，肿块逐 日增大，与周围组织粘连，肿块表面可见丰富的 血管网分布。各组裸鼠肿瘤的生长曲线，见图 1。

图 1 裸鼠肿瘤生长曲线 Figure 1 Growth curves of the tumor in nude mice

图选项

给药14天后颈椎脱臼处死裸鼠。剥取瘤组织 称瘤重，见表 3。

表 3 各组裸鼠平均瘤重、抑瘤率(x±s) Table 3 Average tumor weight and inhibition rates in all groups(x±s)

Notes: a: P>0.05, compared with 5-Fu and DSED group; b: P＜0.03, compared with control group

表选项

RT-PCR结果显示，与对照组、5-Fu组相比， 膈下逐瘀汤+5-Fu组及膈下逐瘀汤组裸鼠移植瘤中 MDR-1 mRNA表达量均显著降低（P＜0.01）,5-Fu 组MDR1 mRNA的表达与对照组之间差异无统计 学意义(P> 0.05)，见图 2、表 4。

1: 5-Fu group; 2: DSED group; 3: control group; 4: DSED +5-Fu grouP＜/span> 图 2 RT-PCR检测瘤组织内MDR-1及β-actin的表达 Figure 2 Expression of MDR1 and β-actin in all groups detected by RT-PCR

图选项

表 4 各组裸鼠移植瘤MDR-1mRNA的相对表达量比较(x±s) Table 4 MDR-1mRNA expression in all groups of transplantation tumor in nude mice(x±s)

Notes: a: P＜0.01, compared with control group; b: P>0.05, compared with control group

表选项

多药耐药是化疗失败的主要原因，肿瘤多药 耐药是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药产生耐药后， 同时对一些未接触过的结构和机制各异的抗肿瘤 药产生交叉耐药现象^[6]。目前逆转MDR-1的化学药 物主要为针对MDR-1的编码产物P-gp的逆转剂， 共包括3代，第一代为环孢素、维拉帕米和奎尼丁 等。第二代主要有：右维拉帕米、右尼古地平、 Psc833和Vx710。第三代包括苯甲酰亚胺衍化物和环丙基二苯并环庚烷化物质等，此外还包括免疫逆 转MDR-1、基因技术逆转MDR-1、核酶逆转MDR 等逆转方法。这些逆转剂等因存在心脏毒性、肾脏 毒性、肝毒性、免疫功能抑制等不良反应而限制了 其临床应用^[7]。中医药由于不良反应小而受到广大 学者的关注，现代分子生物学研究表明丹皮、姜黄 素、三七、毛冬青等[8-11]对耐药均有不同程度的逆 转作用。针对西药单体靶点单一的特点，我们力图 寻找多靶点、多途径、高效低毒的复方中药逆转化 疗耐药，提高化疗效果。

本实验先用MTT法检测耐5-Fu人结肠腺癌细 胞HCT-8/5-Fu的耐药性，结果显示，本细胞株对 5-Fu具有良好的耐药性，耐药倍数为41.94。通过 对DDP、VP-16、VCR的三种结构及机制不同的化 疗药进行耐药性分析，结果显示耐药细胞对三种 化疗药均产生不同程度的耐药性。符合肿瘤细胞 对一种化疗药产生耐药性后，对机制不同、结构 各异其他化疗药产生交叉耐药的特性^[12]，明确了 体外诱导人结肠耐药细胞HCT-8/5-Fu耐药性稳定 的特点。通过造模裸鼠耐药人结肠腺癌移植瘤， 药物干预后结果显示：膈下逐瘀汤+5-Fu组肿瘤抑 制率54.9%高于膈下逐瘀汤组及5-Fu组肿瘤抑制 率，差异具有统计学意义。而膈下逐瘀汤+5-Fu组 肿瘤抑制率与膈下逐瘀汤组相比，差异具有统计 学意义（P＜0.01）。从而说明膈下逐瘀汤能够提 高化疗有效率，与化疗药合用对大肠癌耐药裸鼠 移植瘤生长具有抑制作用。

RT-PCR检测MDR-1 mRNA表达，结果发现，膈 下逐瘀汤+5-Fu组和膈下逐瘀汤组的逆转和翻译水 平显著下降，初步证实膈下逐瘀汤通过逆转MDR-1 基因的表达，增强肿瘤细胞对药物的敏感度。

综上所述，膈下逐瘀汤对大肠癌多药耐药裸鼠 移植瘤生长具有明显抑制作用，能够减缓肿瘤体 积的增长，抑制肿瘤生长，其机制可能为通过逆转 MDR-1的表达而提高肿瘤细胞对药物敏感度。但同 时，耐药问题与Bcl-2蛋白、肺耐药蛋白、谷胺甘肽 S转移酶（GSTs）、拓扑异构酶II(Topo II)等多种因 素有关，下一步我们将更加完善其他耐药指标的检 测，以进一步明确耐药机制及其发挥祖国医学逆转 恶性肿瘤耐药的临床应用。