胰腺癌是一种恶性程度极高、治疗效果及预 后极差的肿瘤，在西方国家总体5年生存率不超过 5%^[1]，且手术切除率仅有10%~15%^[2]，术后不久 就会出现复发和转移。有研究表明^[3]，可切除的 胰腺癌的标准治疗应该是手术加术后系统性辅助 化疗。吉西他滨（gemcitabine，GEM）是第一个 能有效缓解胰腺癌症状和改善预后，具有临床疗 效的新型抗癌药物^[4]，也是经美国食品和药品监 督管理局（FDA）批准的胰腺癌治疗药物，即所 谓的金标准^[5]。但吉西他滨单药治疗胰腺癌的中位 生存期仅为5.4~5.6月，一年生存率仅为16%~19%，效 果仍不理想，这与胰腺癌内在的和（或）获得性的耐 药密切相关。乳腺癌耐药蛋白ABCG2（ATP-binding cassette,subfamily G,member 2）是一种跨膜糖蛋 白，为ABC超家族成员之一。国外已有大量文献报道 ABCG2参与多种肿瘤细胞多药耐药机制[6-8]，甚至被 作为肿瘤干细胞的标志用来筛选肿瘤干细胞。但国 内对于ABCG2与胰腺癌耐药方面报道较少，本实验 旨在探讨GEM诱导胰腺癌细胞中ABCG2的表达及其 与化疗耐药的关系。 1 材料与方法 1.1 细胞株和主要试剂 1.1.1 细胞株

胰腺癌细胞株SW1990由南京医科大 学第一附属医院胰腺中心苗毅教授馈赠。 1.1.2 试剂

GEM（江苏正大天晴药业股份有限公 司），蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（北京 碧云天生物技术公司），RT试剂盒（北京天根生化 科技有限公司），兔抗人ABCG2多克隆抗体（美国 Epitomics公司），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔及 山羊抗鼠IgG抗体、鼠抗人β-actin抗体（北京中杉金 桥生物技术有限公司），ABCG2及β-actin引物由上海 生工生物工程股份有限公司合成。 1.2 试验方法 1.2.1 细胞培养与传代

用0.25%的胰酶及0.02% EDTA的消化液消化SW1990细胞，用含10%胎牛血清 的DMEM高糖培养液，在37℃、浓度为5%CO₂、饱和 湿度的培养箱中培养，细胞每2~3d按1:3传代1次。 1.2.2 MTT法测定SW1990细胞对GEM的半数有 效浓度（IC₅₀）

（1）取70%~80%融合并处于对数 生长期的细胞，调节细胞浓度为每孔5×10³，接种 于含100 μl上述培养液的96孔板中，在37℃、CO₂体积 分数为5%，饱和湿度的培养箱中培养24 h。（2）细胞 贴壁后，更换成含有不同浓度GEM的培养液100 μl， 浓度分别为8、2、0.5、0.125、0.03 mg/ml，每个浓度设 6个复孔，以不加药物的细胞存活率为100%的孔和没 有接种细胞的培养液孔分别作为阴性对照组和空白 对照组。（3）细胞在浓度梯度药物作用下分别培养 24、48和72 h，每孔加入20 μl的MTT试剂，继续培养 4 h后，吸弃培养液，每孔加入200μl二甲基亚砜溶液， 室温25℃振荡8 min使结晶充分溶解。（4）在酶联免 疫检测仪450 nm波长处测各孔吸光度（OD）值，参比 波长630 nm。（5）细胞增殖抑制率（%）=（1-试验孔 OD值/对照孔OD值）×100%，根据IC₅₀计算软件分别 得出24、48及72 h细胞对化疗药物的IC₅₀。 1.2.3 GEM对SW1990胰腺癌细胞内ABCG2的诱导

取融合率为70%~80%处于对数生长期的SW1990 细胞进行消化传代至培养瓶，并调整细胞浓度为 每瓶1×10⁶，在37℃、CO₂体积分数为5%，饱和湿度 的培养箱中培养24 h。待细胞贴壁后，参考24 h的 IC₅₀，更换成含有0.82 mg/ml GEM的培养液4.5 ml， 继续培养24、48和72 h后作为实验组（分别为B组、 C组及D组），以未加GEM的细胞作为对照组(A组)， 检测ABCG2 mRNA及ABCG2蛋白的表达。 1.2.4 流式细胞仪分析细胞凋亡

用不含EDTA的 胰酶消化各组细胞至单细胞悬液状态，1 200 r/min 离心5 min弃上清液后，加入PBS清洗再离心，重 复3次，收集细胞每管1×10⁶，按凋亡试剂盒步骤逐 步进行染色后，在FACS Vantage SE流式细胞仪上 进行检测。 1.2.5 Western blot检测ABCG2蛋白的表达

PMSF 裂解液提取细胞总蛋白，并用BCA蛋白定量试剂盒 定量，取样本蛋白20 μg上样进行10%聚丙烯酰胺凝 胶电泳，调整电泳电压80 V进行30 min，当样本进 入分离胶时，调节电压使其恒定在120 V，维持1 h。 调整恒定电流为50 mA（电流mA=胶长×宽×2.5）， 转78 min（时间=分子量+6 min）至PVDF膜上，用含 5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭2 h。分别加入兔抗 人ABCG2抗体及鼠抗人β-actin抗体于4℃过夜，加入 1:5 000辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔及山羊抗鼠 IgG抗体。进行压片显影，且采用Image J软件测量条 带灰度值并进行数据处理，以β-actin蛋白作为内参 照进行目的蛋白定量分析。 1.2.6 RT-PCR检测ABCG2 mRNA的表达

采 用Tr i zol 法提取实验组、对照组的总RNA。取 10 μ g 反转录合成cDNA，ABCG2 上游引物： 5′-AATACATCAGCGGATACTACAGAG-3′，下 游引物：5′-AGCCACCATCATAAGGGTAAACA T-3'，扩增长度179 bp；内参照β-actin上游引物： 5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物：5′- TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′，扩增长度434 bp。 PCR反应条件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，57℃ 30 s， 72℃ 1 min（35个循环），72℃ 5 min。各取5 μl PCR反应产物混合10 g/L琼脂糖凝胶电泳，通过 Smart View凝胶成像扫描仪观察。 1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，两 样本均数比较采用t检验，多样本均数间比较采用 单因素方差分析，检验水准α=0.05，P＜0.05为差 异有统计学意义。 2 结果 2.1 GEM对胰腺癌细胞株SW1990的增殖影响

MTT结果显示，在同一浓度时，随着作用时 间的延长，GEM对细胞株的抑制逐渐减低，且两 两比较差异有统计学意义（P<0.05），在同一时间 点时，随着药物浓度的增加，GEM对细胞株的抑 制效应逐渐增强，且两两比较差异有统计学意义 （P<0.05）。24 h、48 h及72 h GEM对SW1990细胞 的IC₅₀分别为（0.82±0.08） mg/ml、（1.58±0.16） mg/ml和（2.36±0.15）mg/ml，随着时间延长，IC₅₀逐 渐增加（P＜0.05）。可以得出，GEM对胰腺癌细胞 株SW1990有明显的时间和浓度依赖性，见表 1。

表 1 盐酸吉西他滨对胰腺癌SW1990细胞增殖的影响(x±s) Table 1 Effect of gemcitabine on cell proliferation of pancreatic carcinoma cell line SW1990(x±s)

表选项

流式细胞仪分析显示，0.82 mg/ml GEM作用 胰腺癌SW1990细胞株不同时间后，与对照组相比 较，细胞晚期凋亡率逐渐减低，且两两比较差异有 统计学意义（P＜0.05），见图 1。

A:control group; B: 24h; C: 48h; D:72h 图 1 0.82mg/ml GEM作用胰腺癌SW1990细胞株不同时间点后细胞凋亡分析 Figure 1 Apoptosis of pancreatic cancer cell line SW1990 treated with 0.82mg/ml GEM at different time points

图选项

以β-actin的灰度为内参照，比较β-actin与目的 蛋白ABCG2条带灰度比值。加药后24、48及72 h组 与对照组比较，分别上升（2.17±0.14）倍、（3.61 ±0.09）倍和（4.98±0.13）倍，且加药后24 h与48 h 组、24 h与72 h组、48 h与72 h组两两比较差异均具 有统计学意义（P＜0.05）。提示ABCG2蛋白的表 达具有明显的时间依赖性，见图 2。

A:72h;B: 48h; C: 24h; D:control group 图 2 0.82mg/ml GEM作用不同时间点后胰腺癌SW1990细 胞株中ABCG2 蛋白的表达 Figure 2 ABCG2 protein expression in pancreatic cancer cell line SW1990 treated with 0.82mg/ml GEM at different time points

图选项

以β-actin的灰度为内参照，比较β-actin与目的 基因ABCG2条带灰度比值。加药后24、48及72 h组 与对照组比较，分别上升（2.21±0.11）倍、（3.30 ±0.08）倍和（4.72±0.12）倍，且加药后24 h与48 h 组、24 h与72 h组、48 h与72 h组，两两比较差异均 具有统计学意义（P＜0.05）。提示ABCG2 mRNA 的转录具有明显的时间依赖性，见图 3。

M: marker;A:control group; B: 24h; C: 48h; D:72h 图 3 0.82mg/ml GEM作用不同时间点后胰腺癌SW1990细 胞株中ABCG2 mRNA的转录情况 Figure 3 ABCG2 mRNA transcription in pancreatic cancer cell line SW1990 treated with 0.82mg/ml GEM at different time points

图选项

Doyle在研究维拉帕米筛选的乳腺癌耐阿霉素 株(MCF-7/AdrVP)时发现一段cDNA转染MCF-7细 胞后，细胞株对甲氨蝶呤、阿霉素和柔红霉素产生 了耐药，并降低细胞内柔红霉素的蓄积、滞留，增 加了罗丹明外排，故将其编码的跨膜转运蛋白称 为乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP/ABCG2)。ABCG2介导的多药耐药机制目前 尚不完全明确，一般认为有以下两种：（1）加速化 疗药物的外排，降低细胞内有效化疗药物浓度，尤 其在耐药的肿瘤细胞中，ABCG2可高效运载多种化 疗药物^[9]；（2）影响肿瘤细胞中化疗活性药物的作 用，主要表现在降低药物的活化或增强细胞内药物 的解毒作用，例如甲氨蝶呤，在细胞内通过多聚谷酰 胺化提高活性，作用于靶酶发挥疗效。ABCG2不仅 能转运甲氨蝶呤原型，还能与在细胞内活化的多聚 谷酰胺化形式的甲氨蝶呤高度亲和，与后者结合后 泵出细胞，这种能结合转运药物活化成分的功能是 其他耐药蛋白所不能具备的^[10]。

随着研究的进展，ABCG2的高表达常作为肿 瘤不良预后的指标[11-13]。Benderra等^[14]研究结果表 明：在急性白血病组中ABCG2基因的阳性表达率 达37.6%；ABCG2 mRNA阴性和阳性患者化疗后的 首次完全缓解率分别为79.3%和31.6%；复发组中 ABCG2 mRNA的水平明显高于新诊断组，而在正常 个体和长期存活的白血病患者中，ABCG2基因的表 达水平非常低，ABCG2 mRNA的高表达直接导致 临床耐药的发生，对急性白血病的预后是一个不良 的标志。Zen等^[15]在研究人肝癌标本肿瘤干细胞时 发现，从标本中分离出了少量的侧群细胞，这种侧 群细胞能进行不对称分裂生成，具有无限增殖的能 力，而这种侧群细胞具有高表达耐药蛋白ABCG2的 能力，对细胞毒性药物有很强的抵抗性，对化疗不 敏感。

本研究结果显示，GEM对胰腺癌细胞株有明 显的时间和浓度依赖性。但24、48及72 h GEM对 SW1990细胞的IC₅₀分别为（0.82±0.08）mg/ml、（1.58 ±0.16）mg/ml和（2.36±0.15）mg/ml，这表明随着时 间的延长，SW1990细胞株对吉西他滨的化疗敏感度 逐渐减低，在细胞株中有药物耐药的产生，流式细 胞的结果也得出相似的结论。同时RT-PCR及Western blot结果显示，在使用0.82 mg/ml GEM作用胰腺癌 SW1990细胞株24、48、72 h后，ABCG2 mRNA与蛋 白的表达较未用药组相比逐渐上升，组间比较P值均 小于0.05。说明GEM能诱导ABCG2的增加，呈时间 依赖性，而ABCG2的增加可能促进胰腺癌SW1990 细胞株对GEM的抵抗，使细胞获得化疗耐药，这与 Summer等^[16]研究乳腺癌耐药的结果相似。

总之，GEM能诱导胰腺癌细胞内ABCG2表达升 高，而其表达增加可能就是胰腺癌产生化疗耐药的 机制之一，这对后续研究提高胰腺癌细胞对化疗药 物的敏感度，抑制ABCG2的过表达有着重要意义。