非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer ， NSCLC)为发病率较高的恶性肿瘤，对放化疗敏感 度差，易发生耐药，而且瘤体血管丰富，易早期转 移，现有的治疗效果还不理想。近年来，随着医学 分子生物学理论和技术的发展，针对肺癌发病机制 的靶向分子生物学研究为肺癌治疗开辟了新的途 径。分子靶向治疗肿瘤细胞逆转其耐药、抑制其血 管生成已成为目前抗肿瘤研究的热点。西仑吉肽属 于靶向作用于血管内皮细胞整合素的新型抗血管生 成靶向药物，临床研究结果显示对恶性胶质瘤、脑 和中枢神经系统癌症等具有抗血管生成和生成抑制 双重作用^[1]，但是对于肺癌的研究较少。本研究应 用西仑吉肽对肺腺癌裸鼠的移植瘤模型进行干预， 观察抑瘤效果，探讨其抑瘤机制, 并比较其与化疗 药物顺铂联合应用的疗效。 1 资料与方法 1.1 材料

BALB/c-nu雄性裸鼠(SPF清洁级) 48只，鼠龄 6~8周，体质量16~24 g，由广西医科大学实验动物 中心提供。瘤株：A549人肺腺癌细胞株(实验室自 备)。Trizol、DNAmarker、PCR反应体系购自日本 TaKaRa公司，骨桥蛋白(osteopontin,OPN)mRNA 、 细胞外调节激酶1(cellular signal-regulated protein kinase 1,ERK1)mRNA、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA引物均购 自上海生工生物工程技术服务有限公司，细胞 裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL 化学发光试剂盒均购自上海碧云天生物技术有 限公司，成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血管内皮生长因子受体抑 制剂(SU5416)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、ERK抑制剂(PD98095)购自美国CST 公司，OPN一抗、ERK1一抗、p- ERK1一抗、 VEGF一抗购自美国Santa Cruz公司，辣根酶标记 抗小鼠IgG二抗购自北京中杉金桥生物技术公司。 1.2 裸鼠移植瘤模型制备

A549细胞在37℃、5%饱和湿度CO2培养箱 内，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液中， 每2~3天换液，定期传代，取指数生长期细胞加入 0.25%胰蛋白酶消化1 min，收集细胞并确定细胞活 力在95%以上，调整细胞终密度为2.5×10^{7 /0.2 ml细} 胞悬液备用。

取上述细胞悬液以每只0 .2 ml接种于裸鼠(BALB/c-nu)右下肢外侧皮下，饲养于恒温(26℃ ~28℃)、恒定湿度(40%~60%)的SPF层流实验室 中，用经高压灭菌的饲料和水供动物自由饮食。 接种后每天观察有无肿瘤形成及注射点有无破溃 红肿，隔日用游标尺测量肿瘤大小，肿瘤体积 (mm³)=长径×短径²/2^[2]。 1.3 实验动物分组

待皮下肿瘤生长至长径约0.7 cm时，随机将裸 鼠分为6组，每组8只：(1)空白组：每日腹腔内注 射0.9%氯化钠溶液，每次0.2 ml。(2)顺铂组：每隔 3 d腹腔内注射顺铂稀释液^[3]，每次0.2 ml，注射剂 量为5 mg/kg。(3)小剂量西仑吉肽组：每日腹腔内 注射西仑吉肽稀释液^[4]，每次0.2 ml，注射剂量为 100 μg/d。(4)大剂量西仑吉肽组：隔日腹腔内注射 西仑吉肽稀释液，每次0.2 ml，注射剂量为200 μg/d。 (5)小剂量西仑吉肽+顺铂组：每日腹腔内注射西仑 吉肽稀释液，每次0.2 ml，注射剂量为100 μg/d， 每隔3d腹腔注射顺铂稀释液，每次0.2 ml。(6)大剂 量西仑吉肽+顺铂组：每日腹腔内注射西仑吉肽稀 释液，每次0.2 ml，注射剂量为200 μg/d，每隔3d 腹腔注射顺铂稀释液，每次0.2 ml。。 1.4 A549细胞培养及分组

A549 细胞用含10%新生牛血清的RPMI 1640 培养液接种于培养瓶或96孔板，应用西仑吉肽、 VEGF受体激动剂bFGF、血管内皮生长因子受体 抑制剂SU5416、ERK1受体激动剂EGF和ERK抑制 剂PD98095干预A549 细胞，观察对细胞ERK1蛋 白磷酸化水平及VEGF蛋白的影响。具体如下：先 用无血清的Dulbeccoco改良的DMEM培养液培养 24 h，使细胞同步于G₀期，然后按随机化分配原则 分别分为下列3小组：(1)对照组：不加入任何干预 剂；(2)西仑吉肽组：加入西仑吉肽 4 μg/ml； (3)西 仑吉肽组+bFGF组：加入bFGF10mg/L 1 h后再加入 西仑吉肽 4 μg/ml；（4）SU5416组：加入SU5416 0.4 μmol/L；(5)bFGF+SU5416组: 加入SU5416 0.4 μmol/L 1 h后再加入bFGF 10 mg/L；(6)西仑吉肽组 +EGF组；加入EGF 20 mg/L 1 h后再加入西仑吉肽 4 μg/ml；(7)PD98059组：加入PD98059 10 μmol/L； (8)EGF+PD98059组；加入PD98059 10 μmol/L 1 h 后再加入EGF 20 mg/L，每组设4个复孔。 1.5 观察指标及方法 1.5.1 移植瘤体积及重量

治疗4周后，停药1周，应用水合氯醛处死裸 鼠。剥取肿瘤组织，称重，观察肿瘤转移情况。 肿瘤组织经10%福尔马林固定，石蜡切片和常规 HE染色，按公式计算肿瘤体积。 1.5.2 Western blot检测裸鼠肿瘤中整合素β3、β5蛋白表达

液氮磨组织提取蛋白，首先取100 mg组织加 入0.75 ml细胞裂解液，提取总蛋白。用BCA蛋白 浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度以保证每个上样 孔总蛋白量一致。蛋白变性、上样，12% 十二烷 基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转膜，孵育一 抗(稀释比例1 ：1 000)、二抗(稀释比例1 ：2 000）， ECL 发光，胶片曝光。以β-actin作为内参照。胶 片扫描并照相，测定各条带灰度值。以目的蛋白 和β-actin条带A值之比作为反映目的蛋白表达水 平，实验重复3次。 1.5.3 RT-PCR检测裸鼠肿瘤中OPN、ERK1、VEGF mRNA表达

液 氮 磨 组 织 提 取R N A，首 先 反 转 录 成 cDNA，随后PCR扩增。OPN基因片段，上游 引物序列为：5 ′- CCACATGGCTAAACCCTG ACC-3′，下游引物序列为：5′-CATGGCTTTC GTTGGACTTACTTG- 3′，扩增片段126 bp。 ERK1基因片段，上游引物序列为：5′-GACTC CTACCTGAAGCATAC-3′，下游引物序列为： 5′-TCCTTGACACGCAGAATG-3′，扩增片段203 bp。VEGF基因片段，上游引物序列为：5′-CAGA AAGCCCATGAAGTGGT-3′，下游引物序列为： 5′-CTATGTGCTGGCTTTGGTGA-3′，扩增片段 250 bp。GAPDH作为内参照，上游引物序列为： 5'-TCCCATCACCATCTTCCA-3'，下游引物序列 为：5'-CATCACGCCACAGTTTCC-3'，扩增产物 片段376 bp。PCR 反应条件设置如下：94℃预变性 2 min，94℃变性60 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，35次循环。各取5 μl PCR产物与2 μl溴酚蓝混 合后上样，1.5%琼脂糖凝胶电泳。紫外光下观察 并照相，采用软件分析目的基因和GAPDH条带的 吸光度（A）值，以同一管中目的基因和GAPDH 产物条带A值之比作为反映目的基因mRNA表达水 平的数据。 1.5.4 Western blot检测裸鼠肿瘤中OPN 、ERK1、p-ERK1、VEGF 蛋白表达

液氮磨组织提取蛋白，采用Western blot检测 OPN 、ERK1、p-ERK1/2和 VEGF 蛋白表达。一 抗OPN 、ERK1、p-ERK1和VEGF 按1：1 000稀 释，方法同前。曝光后X线片用凝胶图像分析软件 扫描，测定蛋白条带的灰度值。结果均用实际值 与内参β-actin的比值（A%）表示，每组重复实验3次。ERK1磷酸化水平用p-ERK1与ERK1比值百分 比（%）表示。 1.5.5 Western blot检测A549细胞被干预后ERK1、 p-ERK1、VEGF 蛋白表达

细胞提取总蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂 盒测定蛋白质浓度以保证每个上样孔总蛋白量一 致。余方法同1.5.4，每组重复实验3次。 1.6 统计学方法

数据使用SPSS17.0 统计软件分析，所有数值 以x±s表示。不同组间数据比较采用单因素方差分 析，任意两组均数之间的比较采用SNK-q检验。 P＜0.05 为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 裸鼠肿瘤体积和重量的变化

各组裸鼠均存活到实验结束，无死亡。与对 照组比较，顺铂组、小剂量西仑吉肽组、大剂量 西仑吉肽组、小剂量西仑吉肽+顺铂组和大剂量 西仑吉肽+顺铂组各组裸鼠的肿瘤体积和重量均 显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），与顺 铂组比较，小剂量西仑吉肽+顺铂组和大剂量西 仑吉肽+顺铂组裸鼠的肿瘤体积和重量均显著降 低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与小剂量西 仑吉肽组比较，小剂量西仑吉肽+顺铂组裸鼠的 肿瘤体积和重量均显著降低，差异有统计学意义 （P＜0.05），与大剂量西仑吉肽组比较，大剂量 西仑吉肽+顺铂组裸鼠的肿瘤体积和重量均显著降 低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

表 1 各组裸鼠肿瘤重量和体积的比较x±s Table 1 Comparison of tumor weight and volume in nude mouse modelsx±s

表选项

我们发现，顺铂对整合素β3、β5蛋白无作用 （数据未显示）。与对照组整合素β3蛋白（1.68± 0.09），整合素β5蛋白（1.78±0.12）比较，小剂量西 仑吉肽组整合素β3、β5蛋白（分别为0.79±0.03，0.87 ±0.02）、大剂量西仑吉肽组整合素β3 、β5蛋白（分 别为0.47±0.03，0.38±0.02）表达均明显降低，差 异有统计学意义（均P＜0.05），提示西仑吉肽对 整合素β3、β5蛋白有抑制作用，见图 1。

1: control group; 2: cilengitide alone group(100 μg/d); 3: cilengitide alone group(200 μg /d) 图 1 西仑吉肽治疗后对整合素β3、β5蛋白抑制的影响 Figure 1 Expression of integrin β3 and β5 after treated with cilengitide

图选项

各组OPN之间比较差异无统计学意义。顺 铂组ERK1 mRNA（0.85±0.05）和VEGF mRNA （0.75±0.06）与对照组ERK1 mRNA（0.89±0.06） 和VEGF mRNA（0.76±0.08）比较，差异无统计 学意义，小剂量西仑吉肽组、大剂量西仑吉肽组 ERK1 mRNA（分别为0.51±0.07，0.40±0.05）、 VEGF mRNA（分别为0.43±0.05，0.35±0.02）表 达均明显降低，差异有统计学意义(均P＜0.05)， 提示西仑吉肽对ERK1 mRNA和VEGF mRNA有 抑制作用。与小剂量西仑吉肽组和单纯顺铂组比 较，小剂量西仑吉肽+顺铂组ERK1 mRNA（0.33± 0.04）和VEGF mRNA（0.22±0.03）表达更低，差 异有统计学意义（均P＜0.05）；与大剂量西仑吉 肽组和单纯顺铂组比较，大剂量西仑吉肽+顺铂组 ERK1 mRNA（0.28±0.05）和VEGF mRNA（0.19± 0.03）更低，差异有统计学意义（均P＜0.05），提 示西仑吉肽与顺铂一起有协同降低ERK1 mRNA 和 VEGF mRNA表达的作用，见图 2。

M: Marker; 1: control group; 2: cisplatin alone group; 3: cilengitide alone group (100 μg/d); 4: cilengitide alone group(200 μg/d); 5: cilengitide (100 μg/d) plus cisplatin group; 6:cilengitide (200 μg/d) plus cisplatin group 图 2 各组裸鼠肿瘤中OPN、ERK1和VEGF mRNA表达 Figure 2 mRNA expression levels of OPN, ERK1 and VEGF in each group

图选项

各组OPN之间比较差异无统计学意义。顺 铂组ERK1蛋白磷酸化（83.7±2.5）、VEGF 蛋 白（58.6±2.7）表达与对照组ERK1蛋白磷酸化 （87.9±3.5）和VEGF蛋白（59.2±3.9）比较，差 异无统计学意义，小剂量西仑吉肽组、大剂量西 仑吉肽组ERK1蛋白磷酸化（分别为61.6±2.7， 52.5±2.4）、VEGF 蛋白（分别为42.1±1.2，36.7 ±2.3）表达均明显降低，差异有统计学意义（均 P＜.05），提示西仑吉肽对p-ERK1和VEGF蛋白 有抑制作用。与小剂量西仑吉肽组和单纯顺铂组 比较，小剂量西仑吉肽+顺铂组ERK1蛋白磷酸 化（33.8±1.1）和VEGF蛋白（17.4±1.3）表达更 低，差异有统计学意义（均P＜0.05），与大剂量 西仑吉肽组和单纯顺铂组比较，大剂量西仑吉肽 +顺铂组ERK1蛋白磷酸化（27.0±1.6）和VEGF （15.6±1.1）表达更低，差异有统计学意义（均 P＜0.05），提示西仑吉肽不仅对p-ERK1和VEGF 蛋白有抑制作用，而且与顺铂有协同抑制p-ERK1 和VEGF 蛋白作用，见图 3。

1: control group; 2: cisplatin alone group; 3: cilengitide alone (100 μg/d) group; 4: cilengitide alone (200 μg/d) group; 5: cilengitide (100 μg/d) plus cisplatin group; 6: cilengitide (200 μg/d) plus cisplatin group 图 3 各组裸鼠肿瘤中OPN 、ERK1磷酸化水平和VEGF蛋 白表达 Figure 3 The expression levels of OPN, phosphorylated ratio of ERK1, VEGF protein in each group

图选项

与对照组（8 9 .5 ± 6 .0）比较，西仑吉肽组 p-ERK1蛋白表达下降，ERK1磷酸化水平（61.3 ±5.9）下降，EGF刺激后p-ERK1蛋白表达增加， ERK1磷酸化水平（101.2±7.3）增加，PD98059作 用后p-ERK1蛋白表达明显降低，ERK1磷酸化水平 （42.5±3.7）下降；与EGF组（101.2±7.3）比较， 西仑吉肽+EGF组p-ERK1蛋白表达下降，ERK1 磷酸化水平（68.9±5.5）下降，EGF+PD98059组 p-ERK1蛋白表达下降，ERK1磷酸化水平（70.5 ±4.6）下降，提示西仑吉肽与PD98059具有类似 作用可以抑制EGF刺激后p-ERK1蛋白表达增加， ERK1磷酸化水平增加。

与对照组（0.89±0.08）比较，西仑吉肽组 VEGF 蛋白（0.51±0.07）表达下降，bFGF 刺激 后VEGF蛋白（1.09±0.06）表达增加，SU5416 作用后VEGF 蛋白（0.29±0.03）表达明显降低； 与bFGF组比较，西仑吉肽+ bFGF 组VEGF 蛋白 （0.58±0.03）表达下降，bFGF+SU5416组VEGF 蛋白（0.42±0.05）表达下降，提示西仑吉肽和 SU5416都可以抑制bFGF刺激后VEGF蛋白表达增 加，见图 4。

1: control group; 2: cilengitide group; 3: EGF group; 4: cilengitide plus EGF group; 5: EGF plus PD98059 group; 6: PD98059 group;7: bFGF group; 8: cilengitide plus bFGF group; 9: bFGF plus SU5416 group;10: SU5416 group; EGF: ERK1 agonist epidermal growth factor; bFGF: VEGF agonist basic fibroblast growth factor 图 4 A549细胞中ERK1磷酸化、VEGF蛋白表达 Figure 4 Phosphorylated ratio of ERK1 and VEGF protein expression in A549 cells

图选项

整联蛋白是一类广泛存在于细胞膜表面的膜 受体家族，其中αvβ3和αvβ5对内皮细胞生存和迁 移有重要作用^[5]。如果阻断内皮细胞表面特异性 αvβ3和αvβ5整合蛋白，可以阻止内皮细胞增殖和 迁移，破坏新生血管形成，因此近年研究认为针 对整联蛋白，特别是与血管生成和实体瘤转移有 关的整联蛋白的治疗，有可能成为今后肿瘤治疗 的靶点。细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）通道是一种重要的细 胞内信号转导通道，该通路是Ras、PKC、PKA、 G蛋白、酪氨酸蛋白磷酸酶和丝/苏氨酸蛋白磷酸 酶等多条信号通路的会聚点，参与多种细胞异常 增殖与分化的信号调控。VEGF是目前公认促血管 生成作用最强的因子之一，在多数恶性肿瘤中都 发现VEGF表达增高，肿瘤的生长与肿瘤血管生成 密切相关。SU5416是血管内皮细胞受体磷酸化作 用的抑制剂，在体内外实验中均显示SU5416可抑 制肿瘤细胞生长、微血管生成，增加肿瘤细胞凋 亡。我们前期研究已发现，整合素α5β1的抗体和 siRNA双链均可以通过下调ERK的mRNA和蛋白表 达，并抑制其磷酸化水平从而明显抑制A549细胞 的增殖，促进细胞凋亡、细胞内caspase-3蛋白表达 和抑制细胞内MMP-9蛋白表达，因此整合素α5β1可 能通过介导的ERK信号转导通路参与了非小细胞肺 癌中A549细胞的异常增殖和迁移调控[6-7]。西仑吉 肽模拟多肽cyclo（RGDfV）的结构，是可以抑制 αvβ3和αvβ5整联蛋白的小分子化合物^[8]，目前国外 正在进行西仑吉肽治疗恶性胶质瘤、脑和中枢神 经系统癌症等临床研究[9-10]，有关西仑吉肽治疗肺 癌的研究尚少，西仑吉肽是否会通过ERK信号通 路和VEGF发挥抑制肺癌生长的作用，目前亦研究 较少，我国目前尚未开展西仑吉肽在肺癌的临床 研究。为进一步确认西仑吉肽在体内对于NSCLC 生长的影响，及其与顺铂联用的抑瘤作用，本课 题对西仑吉肽及其与顺铂联用抑制NSCLC裸鼠移 植瘤生长进行了研究。

我们的研究显示，西仑吉肽治疗后裸鼠的肿瘤 体积和重量均显著降低，提示西仑吉肽对NSCLC 裸鼠移植瘤生长有明显抑制作用。Hu等^[11]研究显 示NSCLC肿瘤组织OPN阳性表达率明显升高，且 与肿瘤的大小、分期和转移相关。本研究显示， 西仑吉肽对整合素β3、β5蛋白有抑制作用，且西 仑吉肽对于整合素β3、β5蛋白抑制效应与剂量 一致。西仑吉肽是否通过OPN和整联蛋白发挥作 用？我们进一步研究发现西仑吉肽对OPN并无作 用，西仑吉肽治疗后ERK1 mRNA和蛋白的表达明 显降低，西仑吉肽治疗后VEGF mRNA和蛋白的表 达也明显降低，提示西仑吉肽可能通过抑制整合 素β3、β5蛋白，调节下游ERK信号通路，使得实 体瘤生长受到抑制；而且西仑吉肽在抑制ERK信 号通路的同时可能也抑制VEGF依赖性的肿瘤新生 血管形成，从而在抑制血管生成和实体瘤生长两 方面发挥作用。为此，我们进一步以肺癌A549细 胞为研究对象，观察西仑吉肽、ERK激动剂和抑 制剂、VEGF激动剂和抑制剂对A549细胞p-ERK1 和VEGF蛋白表达的影响。研究显示，当用EGF和 bFGF激活p-ERK1和VEGF蛋白表达增强后，再予 以西仑吉肽处理，A549细胞中p-ERK1和VEGF蛋 白表达下降，提示西仑吉肽可以通过抑制ERK1活 化和VEGF生成来抑制肿瘤细胞的生长。

目前，放化疗是NSCLC的主要治疗手段， 顺铂是肺癌临床治疗的首选药物。它是细胞周期 非特异性药物，可以和细胞内碱基结合，造成 DNA结构和功能损伤，促进细胞凋亡，但常易 引发耐药而致预后较差，而且其毒性反应所导致 的低耐受性也限制了临床应用。因此，寻找低毒 安全的化疗方案是临床上NSCLC治疗的一个重 要方向。本研究结果显示，西仑吉肽联合顺铂作 用后，移植瘤的生长明显受抑制，且与单纯顺铂 组和单纯西仑吉肽治疗组相比，差异有统计学意 义（P<0.05）。此外，西仑吉肽联合顺铂作用后 ERK1、VEGF mRNA和蛋白的表达也明显降低， 与单纯顺铂组和单纯西仑吉肽治疗组相比，差异 有统计学意义（P<0.05），提示西仑吉肽能协同 增强顺铂的作用对NSCLC细胞生长抑制，其机制 可能与阻断ERK1信号活化和VEGF生成有关。这 种联合治疗有望在提高疗效的同时，降低顺铂的 不良反应和耐药性的产生。

综上所述，西仑吉肽抑制肺腺癌A549细胞裸 鼠移植瘤模型中，西仑吉肽不仅本身具有一定的 抑瘤作用，而且可增强顺铂抑瘤作用，其作用机 制可能与西仑吉肽抑制ERK1活化作用和VEGF生 成有关。这一研究为肺腺癌治疗提供实验依据， 但其临床应用仍是—个需要解决的问题。因此有 必要深入研究这类新药的最佳治疗方案，比如如 何筛选可能对该种靶向治疗有效的患者群，或这 类药物相互之间或与手术、化放疗之间的最佳联 合方案。