脑胶质瘤既是颅内最常见的原发性恶性肿 瘤，也是人体中血管化程度最高的肿瘤之一。迄 今为止，因缺乏有效的治疗方法,患者平均生存 期不到1年^[1]。脑胶质瘤的发生也是一个多基因 参与的多阶段的发生发展过程，基因水平决定着 胶质瘤的发生与发展，对胶质瘤进展相关基因的 探索及其发病和分子机制的深入研究将为发现 新的分子疗法和靶向治疗提供依据。已有研究 发现^{[2, 3]}，抑癌基因P53、PTEN/DMBTl的缺失或 突变，EGF/EGFR和VEGF/VEGFR过表达，以及 PDGF-PDGFR、RB、PI3K/AKT、Notch、JAKSTAT 、MAPK、Wnt/β- catenin、 BMPs- Smads信 号通路的改变等分子基因水平的改变与胶质瘤发 生发展相关联，并相互之间存在着错综复杂的串 话机制（cross talking），对脑胶质瘤的发展起到 正调控或负调控的作用。为此，我们在检测脑胶 质瘤BMP2、BMP4的基础上应用反转录-聚合酶 链式反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）技术和免疫组织化学染色 SABC（Strept Actividin-Biotin Complex）法，检 测BMPs/BMPR/Smads通路中关键分子Smad-1、 Smad-2 和 Smad-4的mRNA及其蛋白在正常脑组 织和脑胶质瘤组织中的表达， 探讨其在脑胶质瘤 组织中的表达及其与脑胶质瘤临床分级的关系。 1 资料与方法 1.1 研究对象

收集河南省人民医院脑外科2009年1月—2010 年11月手术切除的新鲜人脑胶质瘤标本40例，年 龄最小为 17 岁，最大64 岁，其中男 26 例，女14 例。患者均为第一次接受手术治疗，且术前均未 行任何放疗和化疗，术后均经病理学切片证实为 胶质瘤。按照WHO脑肿瘤分类标准确定为Ⅰ级胶 质瘤13例，Ⅱ级胶质瘤9例，Ⅲ级胶质瘤11例， Ⅳ级胶质瘤7例。另取脑外伤患者行内减压手术 而取得的新鲜正常脑组织20例作为对照组。从手 术室取得的新鲜标本，切取瘤体中心部位组织， 除部分留作常规病理诊断和免疫组织化学外，其 余组织用无RNA酶去离子水处理后置于液氮中保 存，作RT-PCR检测备用。 1.2 主要仪器与试剂

PCR仪为美国PE公司2720型产品。DNA Marker、Taq DNA聚合酶及一步法RT-PCR试剂盒 均购于大连宝生物公司；琼脂糖为Oxoid公司产 品；Trizol为Invitrogen公司产品；DAB显色剂购 于北京中杉金桥公司；兔抗人Smad-1、Smad-2和 Smad-4三种一抗均为多抗产品，均购自美国AB 公司；二抗为羊抗兔IgG-HRP，由博迈德公司生 产；其他试剂均为国产分析纯。RNA提取所用的 实验耗材、去离子水均为Axygen公司生产的无 RNA酶产品。 1.3 引物序列

由GenBank查找人Smad-1（GenBank Accession Number: NM_001003688） 、 S m a d - 2 （ G e n B a n k A c c e s s i o n N u m b e r : NM_001135937.1）、Smad-4（GenBank Accession Number: NM_005359.5）及内参照GAPDH （GenBank Accession Number: NM_002046.3）基 因序列，利用Primier5.0软件自行设计，进行特异 性和唯一性分析后由北京三博远志生物技术有限 责任公司DNA合成，其序列见表1。

表1(Table 1)

表1 Smads RT-PCR扩增引物 Table1 Smads RT-PCR Primers

表1 Smads RT-PCR扩增引物 Table1 Smads RT-PCR Primers

严格按照Trizol说明书进行操作，用紫外分光 仪测定RNA浓度，并保证A260/A280≥1.8。 1.4.2 cDNA的合成

根据北京三博远志生物技术有限责任公司 DNA合成报告单合成，本OligoDNA是以OD260 为单位来计量的，是指在1 ml体积1 cm光程标 准比色皿中，260 nm波长下吸光度为1A260 nm 的Oligo溶液定义为1OD260单位。根据此定义， 1OD260单位相当于33 μg的OligoDNA，本公司提 供的序列报告中分子量计算公式如下：MW=（A 碱基数×312）+（G碱基数×288）+（T碱基数× 303）-61。 1.4.3 PCR扩增

取第一链cDNA 2 μl，依次加入10 pM下游引物 各2 μl、dNTP4 μl、2 u/μl Taq 酶1 μl、10×PCR buffer 5 μl后，再加入36 μl 无RNA酶去离子水 H2O，轻 轻混匀构建50 μl扩增体系。反应条件为95℃预变 性5 min，94℃ 1 min，55℃ 40 s，72℃ 50 s，进行35个循环，72℃延伸7 min。取PCR产物约5 μl 用1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透照下观察结果， 并拍照。 1.4.4 PCR产物半定量分析

将电泳凝胶置于Gel Doc2000凝胶图像分析系 统进行灰度体积积分分析，以各自内参照的灰度 值为参照，每张图片的每个指标重复6次进行灰 度体积积分测定，取其平均值来反映mRNA的表 达水平。 1.5 免疫组织化学分析 1.5.1 免疫组织化学反应

所有反应均在湿盒中进行。将石蜡切片常规 脱蜡入水后，用pH6.0柠檬酸缓冲液煮沸法进行 抗原修复，0.3% H2O2消除内源性过氧化氢酶， 10% BSA室温封闭，滴加稀释后的一抗(l∶100) 置湿盒中4℃过夜，空白对照用等量的PBS替代一 抗，次日滴加生物素过氧化物酶复合物，室温孵 育1 h；用含0.3% H2O2的DAB液显色5 min左右终 止反应，室温下光镜监视其显色、镜检。 1.5.2 结果判断

镜下观察各组进行免疫组织化学反应的标 本，以胞质内出现清晰可见的棕黄色或棕色颗粒 为免疫组织化学阳性信号，计为表达相应蛋白的 阳性细胞。按照文献^[2]报道的人工计数法，每张 标本于高倍镜（×400）下随机选取10个互不重叠 的视野，统计阳性细胞百分率即阳性细胞占同类 细胞的百分比，以阳性细胞百分率≥10%者为阳 性表达，阳性细胞百分率＜10%为阴性表达。部 分切片染色呈棕黄色染色连成片状不易鉴别者， 阳性细胞百分率计算方法为：(高倍镜下棕黄色染 色面积÷该高倍镜视野总面积)×100%。最后再计 算每组标本的总体阳性率。总体阳性率（%）= （本组阳性标本总数÷本组标本总数）×100%。 1.6 统计学方法

用SPSS 17.0 统计软件对检测结果进行统计分 析，以α＝0.05为检验水准，对相关数据采用χ2或t 检验进行比较分析。 2 结果

RT-PCR扩增结果显示，Smad-1、Smad-2、 Smad-4三者的mRNA在胶质瘤组织中表达显著低 于正常脑组织，且Ⅲ+Ⅳ组显著低于Ⅰ+Ⅱ组。 免疫组织化学染色结果显示，Smad-1、 Smad-2、Smad-4蛋白质表达主要定位于正常脑组 织和脑胶质瘤细胞的细胞质中，呈弥漫分布的棕 色或棕黄色颗粒，强弱不等。蛋白质表达的阳性 率显著低于正常脑组织，且Ⅲ+Ⅳ组显著低于Ⅰ+ Ⅱ组。而Smad-1、Smad-2、Smad-4三者蛋白质表 达的阳性率在不同年龄组及不同性别组患者之间 差异无统计学意义，见图1、2，表2、表3。

图1 Smads RT-PCR电泳图 Figure1 Electrophoretic pattern of Smads after RT-PCR

图2 Smad-1、Smad-2、Smad-4 蛋白在正常脑组织和脑胶质瘤组织中的表达(IHC ×200) Figure2 Expression of protein of Smad-1,Smad-2,Smad-4 in human glioma and normal brain tissue(IHC ×200)

表2(Table 2)

表2 Smad-1,Smad-2和Smad-4 mRNA在正常脑组织和脑胶质瘤组织中的表达（灰度值,x±s) Table2 Expression of Smad-1,Smad-2 and Smad-4 mRNA in Human Glioma(Gray value,x±s)

表2 Smad-1,Smad-2和Smad-4 mRNA在正常脑组织和脑胶质瘤组织中的表达（灰度值,x±s) Table2 Expression of Smad-1,Smad-2 and Smad-4 mRNA in Human Glioma(Gray value,x±s)

表3(Table 3)

表3 Smad-1/2/4蛋白在正常脑组织和脑胶质瘤组织中的表达(标本总体阳性率，%) Table3 Expression of Smad-1/2/4 Protein in human glioma and normal brain tissues (the total positive rate of specimens,%)

表3 Smad-1/2/4蛋白在正常脑组织和脑胶质瘤组织中的表达(标本总体阳性率，%) Table3 Expression of Smad-1/2/4 Protein in human glioma and normal brain tissues (the total positive rate of specimens,%)

Smads蛋白属于转录因子TGF-β超家族，最早 发现于果蝇细胞内的Mad（mothers against dpp） 蛋白和线虫的Sma蛋白，并因此而命名为Smads， 其在TGF-β超家族的细胞内信号传递发挥着非常 重要的作用。目前，在哺乳动物体内已发现主要 有Smad-1～8八个成员，按其功能差异可分为三 类：受体调节型Smads(receptor-regulated Smads， R-Smads)、公用介体型Smads (common-mediator Smads，Co-Smads)和抑制型Smads(inhibitory Smads，I-Smads)^{[4, 5, 6]}。从分子结构上看，Smads蛋 白拥有保守的N末端（MAD Homology 1，MH1） 和C末端（MAD Homology 2，MH2），两者之间 的连接区是非保守的苏氨酸、丝氨酸与脯氨酸。 MH1区是DNA结合的结构区，MH2区则是Smads 蛋白的效应区。两者处于基础状态时互相结合 并抑制对方的功能。R-Smads梭基末端的丝氨酸 被BMPI型受体磷酸化，同时激活的R-Smads/Co- Smads转录复合物形成并转位入核内，再通过与 各类共激活因子或抑制因子结合而调控下游靶基 因的转录。

目前认为^[7]，Smad-1、2属于R-Smads，而 Smad-4是目前唯一在哺乳动物细胞中发现的Co- Smad。Smad-1的主要作用是由BMPI型受体激 活后负责BMPs的信息传导；Smad-2由activin和 TGF-βI型受体激活后主要介导TGF-β和Activin信 号转导，而对BMP-2则无反应，TGF-β和Activin 亦不能诱导Smad-1磷酸化；而Smad-4是作为 BMPs和TGF-β/activin两条信号途径共用的转录因 子存在，特别是对TGF-β信号的转导具有较强的 控制作用；同时，Smad-4还表现为其他Smads的伙伴，与活化的R-Smads结合为异聚体后从细胞 质向细胞核移行，在细胞核内调控下游靶基因的 表达，进而改变细胞的生物学特性。

此外，大量研究证实^{[8, 9, 10, 11, 12, 13]}，某些Smads基因 的突变、失活、异常表达，以及因泛素化等原 因引起的Smads蛋白的功能丧失与许多肿瘤的发 生、发展、浸润及转移等相关，如有研究结果提 示^[7]，胶质瘤的发生和恶性进展过程中，伴有磷 酸化Smad-1(phosphorylated-Smad-1，P-Smad-1) 的磷酸化活化障碍， Smad-1的蛋白表达随着胶 质瘤恶性级别的增高而降低。已有人从体外研 究证实了这一点^[14]，其结果显示，磷酸化Smad- 1(phosphorylated-Smad-1，P-Smad-1) 可抑制胶母 细胞瘤细胞系U251的增殖，诱导瘤细胞的分化和 凋亡，其蛋白表达随着胶质瘤恶性级别的增高而 降低。

本研究显示，与正常脑组织相比，脑胶质瘤 组织中Smad-1、Smad-2、Smad-4 mRNA和蛋白表 达水平显著降低（P<0.05），并随着肿瘤恶性级 别的增高而降低，Ⅲ+Ⅳ组与Ⅰ+Ⅱ组之间差异有 统计学意义(P<0.05),与已有研究^{[15, 16]}结果相近。 另外，Smad-1、Smad-2、Smad-4在人脑胶质瘤组 织中随病理分级的增加而表达减少(P<0.05)，也 反映出人脑胶质瘤组织中与癌组织的分化有着明 显的关系，分化越低，其表达越少。我们分析， 可能是因为其上游的BMPRⅠa 、BMPRⅠb、 BMPR Ⅱ三种受体的表达降低，BMPs无法发挥 调控其表达所致；而正是因为Smad-1、Smad-2、 Smad-4的表达降低，直接失去了其自身或间接失 去了其他细胞信号转导通路对细胞的增殖抑制和 促进其分化、凋亡的作用，而导致了肿瘤的发生 与向恶化进展。比如除了直接丧失了Smad-1的作 用外，也可能因为Smad-2、Smad-4蛋白的表达 缺失，导致细胞逃脱TGF-β的抑制作用，促进了 人脑胶质瘤的发生，并在已发生癌变的组织中继 续参与人脑胶质瘤的侵袭及演进。由于Smad-1、 Smad-2、Smad-4在脑胶质瘤组织中，是随着胶质 瘤的发生和病理分级同步降低的，我们认为三者 可能对胶质瘤的发生和发展起着相同的作用。